Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)
p>в
компаунде с
другими аллелями,
в том числе с
delF508, обна-руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя-
щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза
у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер-
та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия,
обусловленного аллельными сериями.
В настоящее время в России доступны идентификации по
наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом
(Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность
основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле-
дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),
394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на-
шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко-
висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се-
мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные
сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости
(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми-
нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена
СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et
al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При
отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным
сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи-
мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер-
ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;
Баранов и др.,1991).
Методами направленного мутагенеза (gene targeting
см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании
осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей
муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et
al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы-
яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия
проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано,
что различные мутации этого гена по-разному реализуются в
фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных
линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других -
поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии
наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход-
ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии
представляют собой идеальные модели для исследования молеку-
лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ-
ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте-
рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге-
нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7
центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и
Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген-
ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо-
дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические
испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70
пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача-
тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль-
тур.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная
дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - мио-
дистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию
Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых
крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин,
входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист-
рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре
после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин
присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном
состоянии.
В соответствии с современными представлениями (Ahn,
Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож-
ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней
мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную
специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и
на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора
экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время
как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю-
чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6-
и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси-
руются, образуя несколько структурно различающихся форм
дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи-
цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще-
еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка-
нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок
значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото-
рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в
мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса,
экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в
Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам
дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу-
чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще
один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро-
фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et
al., 1993).
В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи-
ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до
нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух
"горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и
в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова-
ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси-
мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене-
зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.
Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как
изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях
повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной
делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4%
(Passos-Bueno et al., 1992).
Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в
разных европейских популяциях, а также в популяциях России и
стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де-
летирован не только весь ген, но достаточно протяженные
соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в
центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44,
протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз-
рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной
из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб-
ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо-
зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко-
торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы,
размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов-
торены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза неста-
бильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подоб-
ного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких
случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у паци-
ентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть
имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В
2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сик-
венс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов.
В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не-
гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).
Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и
протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор-
мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием
или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо-
жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки -
дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена
дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута-
ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук-
леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий
процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с
присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му-
тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.
Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с
МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи-
мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен-
ные формы.
Разработаны очень эффективные методы диагностики деле-
ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре-
менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз-
воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et
al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де-
леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи-
ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп-
лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование
(Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод
иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на
гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et
al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют
косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген-
ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;
124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид-
ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше-
ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и
др., 1990).
Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного
носительства и, следовательно, для медико-генетического
консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад-
ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад
женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою
очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов)
половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами
дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни-
кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран-
них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори-
ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа-
ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце-
нить величину аберрантного клона ооцитов практически не
представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении
здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери
больного МД не удается определить гетерозиготное носительст-
во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали-
чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при
отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного
носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно-
го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et
al.,1992).
У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто-
химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро-
фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител
с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным
участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-
вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят-
ный механизм такого явления - возникновение второй сомати-
ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки
считывания, вызванный основной делецией. В результате му-
тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль-
ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).
Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -
mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,
спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,
1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается
резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол-
ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини-
ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована
нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей
транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже-
на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо-
на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).
В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи-
альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина
человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали
после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер-
ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро-
фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив-
ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,
1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-
венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант-
ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной
ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных
(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче-
видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да-
лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты
исследователей о перспективности генной терапии МД по срав-
нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных
миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини-
ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу
IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи-
мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро-
фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен-
но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования
по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и
в нашей стране.
10.4.3 Гемофилия А.
Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное
наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в
системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора
YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х
компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном
F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-
зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-
ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-
рует его активность.
Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-
жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая
длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-
дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009
нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность
(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806
п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в
интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-
известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами
молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-
роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в
направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый
экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие
его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется
он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена
экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;
Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22
оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-
ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41
