скачать рефераты
  RSS    

Меню

Быстрый поиск

скачать рефераты

скачать рефератыРеферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная

ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа-

ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети-

лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са-

мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а

также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге-

номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности

некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть

прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба-

ранов, 1991).

В GC-богатых изохорах локализовано большое количество

CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха-

рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина

(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован-

ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов,

родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных

факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;

Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов

узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы

HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих

неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%

Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,

CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь-

ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки-

пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв-

ляются характерной особенностью транскрибируемых участков

генома. Их идентификация в клонированных последовательностях

геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных

структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG

островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,

15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр-

ные методы регистрации СрG островков показали, что их число

в геноме человека приближается к 45000 (

Antequera,Bird,1993).

Можно также отметить существование в геноме человека

сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур-

но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та-

ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви-

димому, это необходимое, но не достаточное условие их

экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме-

няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко-

торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион-

ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи-

тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа-

ях это области функционально активных генов, находящихся в

деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.

Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви-

тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод

ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро-

мосомных препаратах визуализировать функционально активные

районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба-

тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по-

мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече-

ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно

только в те участки хромосом,где находятся функционально ак-

тивные гены (Verma, Babu, 1989).


ГЛАВА YIII.


БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.


Раздел 8.1. Генетические линии животных.


Большая роль в исследовании проблем генетики челове-

ка и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим

линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей

(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент

сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирую-

щими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных

генов млекопитающих и человека, а также наличие большого

числа консервативных групп сцепления с идентичным расположе-

нием генов наряду с возможностями использования очень мощных

экспериментальных подходов для идентификации и клонирования

генов линейных животных позволяют проводить параллельные

исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и

молекулярного анализа индивидуальных генов человека.

Для многих моногенных заболеваний человека животные,

несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а

зачастую и единственными моделями для исследования молеку-

лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече-

ния, в том числе и с применением методов генной терапии

(см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде

всего, ведется, среди уже существующих генетических линий

животных с установленным типом наследования определенных

аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до-

казательство идентичности мутантных генов и, соответственно

первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных

животных.

В различных питомниках мира, в том числе и в России,

созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков

до несколько сотен генетических линий различных эксперимен-

тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню-

хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и

др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно-

гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости,

удобства содержания, относительной легкости эксперименталь-

ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые

из этих линий представляют собой случайные находки, другие,

а их большинство, получены в результате действия различных

мутагенных факторов. Так, значительное число биологических

моделей было получено путем биохимической селекции потомства

мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз-

мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так

были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия,

почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу-

чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск

спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу-

чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного

гена.

Процесс создания подобных генетических линий обычно

включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ

наследования этих фенотипческих признаков; длительное близ-

кородственное разведение отселектированных особей. При моно-

генном наследовании такие линии могут либо целиком состоять

из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерози-

готных особей в случае сниженной жизнеспособности и наруше-

ния плодовитости у гомозигот.

На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо

моногенного наследственного заболевания руководствуются

сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом

мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста-

точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность

генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока-

зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из-

менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная

мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько

сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу-

ются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели

наследственных болезней известны и достаточно полно изучены

для многих других экспериментальных и домашних животных.

Представляется удивительным, что, несмотря на большое

сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первич-

ной структуре и тождественных по функциям структурных генов,

для значительной части наследственных болезней человека ге-

нетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Ко-

нюхов, 1969).

Это ограничение в настоящее время может быть преодалено

путем целенаправленного конструирования генетических модель-

ных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода

уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;

Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют

технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволо-

вых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генет-

ческим изменениями и пересадку их в зародыши или в сомати-

ческие ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных ге-

нов in vivo и оценки их биологического действия особенно

удобными оказались трансгенные животные.


Раздел 8.2. Трансгенные животные.


Трансгенных животных получают в результате искусствен-

ного введения - трансгеноза, чужеродного генетического мате-

риала, представляющего из себя фрагмент гена или иную после-

довательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние

зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными

экспериментальными системами для исследования молекуляр-

но-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чуже-

родного гена, оценки его биологического действия на орга-

низм, а также для производства различных манипуляций со спе-

цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколь-

ко способов получения трансгенных животных. Исторически бо-

лее ранним и широко применяемым до настоящего времени явля-

ется микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро опло-

дотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого

метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода

состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи мик-

романипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцек-

летки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров

раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в

нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дроб-

ления случайным образом интегрирует в один из сайтов ка-

кой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.

При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различ-

ных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интег-

рация может происходить в разные хромсомные сайты и число

интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может зна-

чительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион

развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках

такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится

только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных

особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После

введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку транспланти-

руют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве

таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что по-

добный механический вариант трансфекции чужеродных генов на

ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.

Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа

геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, ис-

пользуя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрес-

сию введенного гена анализируют путем идентификации специфи-

ческих мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в раз-

личных тканях трансгенного животного.

Другой, более более прогрессивный способ получения

трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвер-

гается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые

клетки (см.ниже), которые затем трансплантируют в полость

бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преи-

мущества в плане генетического моделирования подробно

рассмотрены в разделе 8.4.

Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хро-

мосому образует блок из множества тандемно расположенных ко-

пий, при этом число единиц повтора в блоке у разных

особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.

После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генети-

ческие конструкции устойчивы и стабильно передаются по-

томству в соответствии с законами Менделя. Встраивание вве-

денной ДНК в функционально значимые области генома может

приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением

мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом,

животные, полученные при введении одного и того же гена, бу-

дут различаться как по сайтам интеграции, так и по количест-

ву копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях,

по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.

Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле

уникально.

Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обь-

ектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции

его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введен-

ного гена у животных, различающихся по длине фланнкирующих

последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность об-

наружить элементы гена, контролирующие его работу в разных

типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последова-

тельностей гена часто вводят генетические конструкции, соче-

тающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого

выражается в появлении известной и легко определяемой фер-

ментативной активности. Использование для трансгеноза реком-

бинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комби-

нации регуляторных элементов и кодирующих последовательнос-

тей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механиз-

мов активации генов в разных типах тканей.

Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже-

родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию

нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк-

лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с

уже известными наследственными нарушениями у человека и по-

добные животные также могут использоваться в качестве гене-

тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для

получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых

решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем

трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-

нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи-

ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо-

вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно

(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до-

полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше-

нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс-

твие этого, было причиной патологических процессов.


Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.


Другой вариант биологического моделирования основан на

получении животных с определенными очень специфичными, но

ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть

использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и

разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько

примеров подобного экспериментального моделирования.

Описанная технология трансгеноза (введение генов в про-

нуклеус) может быть использована, в частности, для направ-

ленного получения животных с избирательными дефектами

(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41


Новости

Быстрый поиск

Группа вКонтакте: новости

Пока нет

Новости в Twitter и Facebook

  скачать рефераты              скачать рефераты

Новости

скачать рефераты

© 2010.