Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)
p>венирования.
При наличии
в амплифицированном
фрагменте из-вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред-
варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре-
зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот-
кие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли-
ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения
легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про-
тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы-
явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри-
дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и
эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп-
ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз-
личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе-
рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни-
ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет
легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе
(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден-
тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо-
дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю-
шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро-
ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок-
рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в
исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут
отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег-
рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам-
плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от-
дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали-
зацию.
Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции,
находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в
аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова-
тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика-
ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле-
ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно
дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика-
ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод
идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на
использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу-
ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или
из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей
или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо-
лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны
сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб-
раны последовательности из этих областей гена, только му-
тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь-
шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо-
нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может
быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.
Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным
внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь-
зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию
фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали-
чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации
необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к
отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их
размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при
электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или
агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется
для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му-
ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле-
ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест-
рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо
провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре-
деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после-
довательности по сравнению с нормальной.
При мутациях гена, представляющих собой замену одного
или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен-
тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими-
ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри-
мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор-
мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше-
ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо-
бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных
фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду-
щими из этих методов являются: метод анализа конформационно-
го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра-
диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп-
ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно-
го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования
Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3
Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер-
вичной идентификации мутаций.
-------T---------T--------T------------T----------------¬
¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦
¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+
¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------+---------+--------+------------+---------+------+
¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦
¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦
¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦
L------+---------+--------+------------+---------+-------
"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и
кДНК
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод
анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред-
ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на
регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-
нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся
вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа-
ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших
однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной
последовательности, так что замена даже одного основания в
молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост-
ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи-
ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований,
обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра-
зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек-
рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово-
дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения
ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме
используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT
Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с
этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се-
ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные
внешние факторы - температура, концентрация акриламида и
глицерина в геле, ионная сила буферных растворов
(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз-
воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК,
различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный
метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое
распространение благодаря своей простоте и возможности обна-
руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций
при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о.
составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400
п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме-
тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан
на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших
двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь-
ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых
фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ-
ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению
со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди-
намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж-
ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при
их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра-
диент денатурации достигается разницей температур, различной
концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих
условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК,
отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру-
ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю-
щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле-
отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При
электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в
геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату-
рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго
специфичной для данной последовательности области, эквива-
лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу-
ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью
может соединиться или разойтись. После начала плавления
продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля-
ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле-
кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не
наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит
разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному
составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около
50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до
нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при
прохождении ДНК через гель может начаться частичная денату-
рация концов молекул еще до достижения оптимальной области
плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов ам-
плифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на
процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффектив-
ность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатуриру-
ющего электрофореза может быть существенно повышена за счет
присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синте-
тических фрагментов GC-нуклеотидов, длиной в несколько
десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы
выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают
шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от
их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта моди-
фикация делает метод очень чувствительным (см.Таб.4.2). В
отличии от SSCP он пригоден для более крупных амплифициро-
ванных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600
п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает
95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута-
ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы
используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом
применен также для анализа индуцированных мутаций, так как
позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од-
ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме-
тода следует отнести техническую сложность получения равно-
мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном
геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных
GC-концов.
HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз-
воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или
в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля-
ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы-
ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных
хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо-
логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но
их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.
Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых
в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких
мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута-
ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в
том, что при амплификации относительно небольших фрагментов
генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может
быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич-
ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти-
пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль-
ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле-
кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав-
нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под-
вижности) за счет конформационных особенностей в местах
несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия
могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри-
ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо-
и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании
новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность
идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах
ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу-
ществляется как изотопным, так и неизотопными методами
(Grompe, 1993).
CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического
расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности
некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК
в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так,
цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к
действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода
используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.
Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву
молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций
осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих,
как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.
Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды,
клонированные последовательности ДНК или амплифицированные
фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).
При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме-
шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми
образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные
соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные
фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых
молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо-
вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах
ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации
между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК,
образуются места негомологичного спаривания. После обработки
соответствующими химическими агентами идентификация и лока-
лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово-
дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко-
роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео-
бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии
мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41
