Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>длине путем электрофореза в агарозном или полиакриломидном

геле, и тем самым может быть определена их молекулярная мас-

са, а, значит, и физическое расстояние между сайтами. Напом-

ним, что обычным методом выявления ДНК в геле, также как и

РНК, является ее специфическое окрашивание, чаще всего эти-

диумом бромидом, и просмотр геля в проходящем ультрофиолете.

При этих условиях места локализации ДНК имеют красную окрас-

ку. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз

с последующим электрофоретическим анализом перекрывающихся

аддитивных по длине фрагментов ДНК можно добиться полного

упорядочивания сайтов узнавания для каждого из ферментов от-

носительно друг друга и каких-то иных маркеров, присутствую-

щих в исследуемой молекуле ДНК. Процесс этот называется фи-

зическим картированием и является обязательным элементом

анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относи-

тельно небольших фрагментов ДНК эукариот. На рис.1.2. предс-

тавлен простейший пример такого картирования в том случае,

когда в исследуемой молекуле ДНК присутствует по одному сай-

ту рестрикции для двух эндонуклеаз. После обработки исходной

ДНК отдельно каждой из рестриктаз образуется два фрагмента,

соответствующих по длине расстоянию от концов молекулы ДНК

до сайтов рестрикции. При совместной обработке обеими эндо-

нуклеазами на электрофореграмме появляется новый фрагмент,

размер которого соответствует расстоянию между сайтами рест-

рикции. Очевидно, что эти данные еще не позволяют однозначно

определить положение сайтов рестрикции по отношению к концам

молекулы ДНК. Однако, достаточно знать расположение хотя бы

одного маркера для того, чтобы произвести точное физическое

картирование исходной молекулы ДНК независимо от количества

локализованных в ней сайтов рестрикции.

При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, в

частности ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонукле-

азами образуется так много фрагментов различной длины (в

среднем, порядка 1 миллиона), что их не удается разделить с

помощью электрофореза, то есть не удается визуально иденти-

фицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме.

После электрофореза рестрцированной геномной ДНК получается

равномерное окрашивание по всей длине геля - так называемый

шмер. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле воз-

можна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Это

достигается при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну.

1.3. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.

Одним из наиболее эффективных методов идентификации

определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделен-

ных фрагментов является ставший уже классическим метод

блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора Edцuard So-

uthern, предложившего данный метод в 1975г . Последователь-

ные этапы данного метода представлены на Рис.1.3. Суть мето-

да заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрик-

ции одной или несколькими рестриктазами, после чего образую-

щиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агароз-

ном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатура-

ции in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно

нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам пере-

нос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных

сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на филь-

тре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым ДНК или РНК зон-

дом. Методом авторадиографии определяют положение искомого

фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридиза-

ция - высоко чувствительный метод идентификации специфичес-

ких последовательностей ДНК. При достаточно длительной экс-

позиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной

радиоактивности ДНК-зонда (более 10!9 расп/ мин/микроГ) этот

метод позволяет выявлять менее, чем 0,1 пикоГ ДНК. Так при

использовании зонда размерами в несколько сот оснований уни-

кальная последовательность в 1 000 п.о. может быть выявлена

в 10 микроГ геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной

полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12

часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олиго-

нуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хо-

рошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходи-

мость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокоме-

ченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей

процедуры делают её весьма дорогостоящей. Тем не менее, в

ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения в

том числе и для диагностики генных болезней. В последнее

время для этих целей нередко используют различные варианты

нерадиоактивного мечения или окраску ДНК азотно-кислым се-

ребром.

Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или

РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предвари-

тельной рестрикции и электрофореза носит название дот- или

слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на

фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На

рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих мето-

дов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с

электрофоретически разделенными молекулами РНК носит назва-

ние Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот - это

связывание электрофоретически разделенных белков, фиксиро-

ванных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих ме-

тодов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Сау-

зерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен-

тальных подходов, используемых для анализа ДНК.

В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зонда-

ми не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.

Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на

фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромо-

сомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in

situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов исполь-

зуются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называ-

ется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый

ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и

подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафаз-

ных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена

на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение

имеет также подбор условий, максимально способствующих про-

цедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК

и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании

радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обра-

ботки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК

зондов) места локализации последовательностей ДНК, компле-

ментарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно

наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответс-

твующими участками определенных хромосом (Рис.1.4).

Гибридизация in situ, является одним из наиболее эф-

фективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду

последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно

эффективна при исследовании распределения по геному повторя-

ющихся последовательностей ДНК, клонированных последователь-

ностей ДНК анонимного происхождения, при определении не

только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной

локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются

соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность

метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Сог-

ласно последним данным, в экспериментах на специально приго-

товленных и растянутых интерфазных хромосомах человека раз-

решающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что

составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного

бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов

ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успе-

хом решаются методом FISH.

Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми

зондами, проводимая на гистологических препаратах, является

одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифи-

ческого распределения и внутриклеточной локализации мРНК

(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными мето-

дом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их

многочисленными модификациями и вариантами можно ознако-

миться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,

1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.

ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК огра-

ниченного размера, используемая для поиска комплементарных

последовательностей в молекуле большего размера или среди

пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве

зондов используют искусственным образом синтезированные оли-

гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно

не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить вы-

деленные из генома последовательности ДНК. Однако значитель-

но чаще такие последовательности предварительно клонируют,

чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неог-

раниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание

(инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу

ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бакте-

риальные клетки хозяина (Рис 1.5). Химерные молекулы ДНК,

составленные из фрагментов разного происхождения, носят наз-

вание рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов

используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро-

и аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс-

трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от со-

тен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, глав-

ным образом, способностью вектора удерживать чужеродный

фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов

плазмидную ДНК.

Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные мо-

лекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе

копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с

изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока-

залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие

клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря

чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз

и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются

плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заме-

тим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе

не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как

при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штам-

мы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды

имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую

поддержание их количества в клетке на определенном уровне -

от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.

Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным

контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клет-

ке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клони-

рующих векторов заключается во внесении изменений в систему

контроля репликации и в добавлении или вырезании генов анти-

биотикоустойчивости или удобных для клонирования иных гене-

тических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициа-

ции и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро-

вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.

Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести

в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализа-

ции уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраива-

ние, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной

молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов

-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает коль-

цевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные

методы трансформации бактерий, то есть искусственного введе-

ния плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие

в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в ка-

честве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на

соответствующих селективных средах. При размножении

трансформированных бактерий происходит увеличение числа ко-

пий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чу-

жеродный для бактерий генетический материал может быть полу-

чен, практически, в любых количествах. Выделенная из бакте-

рий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро-

ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в ка-

честве ДНК-зондов.

Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов

оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.

Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при

ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с

чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто техни-

чески эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако,

размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью го-

ловки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают

последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна-

чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может су-

ществовать только в том случае, если в него встроена чуже-

родная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой

ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на

основе фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.

Многие проблемы молекулярной генетики успешно решаются

с использованием экспрессионных векторов, содержащих в своем

составе регуляторные последовательности, обеспечивающие син-

тез чужеродных белков в клетках хозяина. Так в случае лямбда

gt11 фаги могут быть выращены в, так называемых, репликатив-

ных условиях, обеспечивающих экспрессию инсертированной ДНК.

Так как обычно ДНК встраивают в район локализации маркерного

гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то

экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть поли-

пептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а

часть цепи будет транслироваться в соответствии с информаци-

ей, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок мо-

жет быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного

белка либо с помощью антител к специфическим участкам, коди-

руемым чужеродной ДНК.

В последнее время большое распространение получило

клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе

преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе

плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда,

отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы

могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фа-

говых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей

способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами

и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной

ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клониро-

вания в прокариотических системах.

Векторы, пригодные для направленного переноса в эука-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41