Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,

что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-

ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-

мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.

Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-

нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-

кая информативность (частота гетерозигот не может превышает

50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение

ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-

шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-

тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК

последовательностей в качестве индексных генетических марке-

ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-

ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-

лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно

распределенных по хромосомам практически завершенаа

(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система

построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.

(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс

простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-

чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-

мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных

на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются

после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более

90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-

ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В

1992г. группе французских ученых под руководством Жана

Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-

мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации

(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из

814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-

нием между ними около 5 сМ, получившую название

Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et

al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000

фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем

ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры

для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-

жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.

Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000

(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих

участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-

дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-

лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-

тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-

держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта

сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-

нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.

Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а

суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%

всего генома человека.

К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до

2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен

до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-

вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-

ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-

ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического

скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих

весь геном человека со средним расстоянием между соседними

маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из

Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-

ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-

лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),

причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены

четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-

го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-

рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9

STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-

ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.

Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим

сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.

Только с помощью одного автоматического сканнера удается

проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в

день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-

ет самые широкие возможности не только для генетического

картирования и создания подробных карт сцепления практически

любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,

она делает реальной разработку стратегии картирования генов,

мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-

леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,

психозы и многое другое.

Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров

и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур

или на материале информативных родословных можно довольно

быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не

только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-

ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-

посредственно к позиционному клонированию с целью выделения

и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в

картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим

подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-

ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-

мосом и их фрагментов.

Точность цитогенетического картирования определяется

степенью спирализации хромосом, характером использованной

метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-

вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах

и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-

рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-

том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При

использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах

точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1

миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и

растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50

тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,

даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-

тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-

чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.

Значительно более точные результаты достигаются на 2-м

этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.

Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на

рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.

Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети-

ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление

этих типов физических карт практически невозможно.

Одним из способов преодоления этих трудностей является

конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как

уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких

библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги-

бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме-

ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото-

рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб-

лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.

Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен-

ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь

часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны

могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото-

рых механически, под контролем микроманипулятора может быть

вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.

Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и

идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз-

мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным

после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК

на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти-

дов (Estivill, Williamson, 1987).

Другим важным шагом на пути клонирования и анализа

больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка

методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую-

щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith

et al., 1987). В соответствии со стандартными методами

электрофореза под действием однонаправленного постоянного

поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде-

лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.

Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем

изменении направления электрического поля происходит, по

-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных

скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю-

чения направления поля. При этом более короткие молекулы

легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в

геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего

гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри-

ческим расположением направлений полей - ортогональный,

гексогональный, инверсионный. При использовании любого из

этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от

50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-

ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от

условий проведения электрофореза (напряжение, температура

буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-

честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК

используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной

массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих

специфические последовательности, также может быть осущест-

влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и

идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из

геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-

роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с

целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В

последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-

ментов ДНК широко используется метод клонирования в

искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения

библиотек генов на основе YAC-векторов.

Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки

по хромосоме, идентификация и изоляция генов.

Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют

около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.

4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов

и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар

нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых

с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза-

ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых

минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после-

довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест-

вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе-

ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи-

тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол-

ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно

содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят

упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени-

ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов-

ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти-

фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее

мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых

можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ-

ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ-

ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это

насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ-

фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро-

вания различными методами инсертированных в них фрагментов

ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо-

ванными в заданном районе. Значительно чаще используется

тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,

сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред-

варительно отобранных на основании сцепления с различными

ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных

сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск

в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые

последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими

методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по

хромосоме.

"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование

(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со-

держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде-

ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе

проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп-

ленной с геном. После нахождения положительных клонов

последние сами служат зондами для изоляции других клонов,

содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким об-

разом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качест-

ве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В ре-

зультате получют набор клонированных фрагментов ДНК, пол-

ностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных

клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-

тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно

установить степень перекрывания между соседними фрагментами

и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".

При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого

нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-

ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким спосо-

бом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном

направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно

клонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса

поиска генных последовательностей американским исследовате-

лем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Че-

ловека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот

метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в гено-

ме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),

не изолируя при этом все промежуточные последовательности

ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной

схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то

есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с

геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переварива-

ется редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются

большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыж-

ку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за

счет искусственного присоединения к их концам небольшого

маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41