Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>экзона 2 гена GBA при болезни Гоше. Появление в результате

точковой мутации в интронной области нового сайта сплайсинга

также может сопровождаться структурными перестройками. Тако-

ва, в частности, природа 33-нуклеотидной инсерции в гене PSAP

при метахроматической лейкодистрофии, обусловленной дефицитом

SAP1; 24-кб инсерции в гене HEXB при болезни Зандхоффа и

5-нуклеотидной инсерции в гене IDUA при синдроме Шейе. Важно

отметить, что подобные мутации совместимы с образованием не-

большого числа функционально активных мРНК, следствием чего

является относительно более мягкое течение соответствующих

форм заболеваний.

В некоторых случаях возникновению мутаций может

способствовать наличие псевдогена. Молекулярный анализ псев-

догена, тесно сцепленного с геном GBA, показал, что, по

крайней мере, 4 мутации, обнаруженные у пациентов с болезнью

Гоше, присутствуют в норме в псевдогене. Это 2 мажорные му-

тации - L444P и IVS2+1 и еще 2 миссенс мутации в 10-м экзоне

(A456P и V460V). Подобное сходство несомненно указывает на

фундаментальную роль псевдогена в образовании мутаций в

GBA-гене. В то же время само по себе присутствие псевдогена

не является мутагенным фактором, особенно если сам ген и его

псевдоген локализованы в разных хромосомах, как, например, в

случае генов GM2A и FUCA1, псевдогены которых находятся в

хромосоме 3 и в области 2q31-q32, соответственно.

Для двух лизосомных болезней - фукозидоза и синдрома

Гурлера, мажорными являются нонсенс мутации. Более того, при

фукосидозе все известные к настоящему времени мутации приво-

дят к полному отсутствию продукта FUCA1-гена. Так, наряду с

мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у

больных фукосидозом, описаны еще 4 нонсенс мутации и 4 деле-

ции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера две

мажорные нонсенс мутации - W402X и Q70X, составляют около

50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того,

при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по

частоте нонсенс мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считы-

вания. 3 миссенс мутации и интронная мутация, создающая до-

полнителный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к пол-

ному блоку синтеза идуронидазы и реализуются в виде синдрома

Шейе. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурле-

ра и синдром Шейе, являются классическим примером фенотипи-

ческого разнообразия, обусловленного существованием аллель-

ных серий (см.Главу IV). Такой спектр крайне тяжелых мутаций

нельзя объяснить только повышенной частотой их возникнове-

ния. Более вероятным представляется предположение о том, что

кодируемые FUCA1- и IDUA-генами белки обнаруживают опреде-

ленную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют

функциональную активность при определенных аминокислотных

заменах, то есть миссенс аллели в этих генах проявляют себя

как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболева-

ний.

Хорошо известно, что распространение мутаций в популя-

циях определяется не только, и не столько повышенной часто-

той их возникновения, но многими другими популяционно-гене-

тическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом

основателя (см.Главу V). Типичным следствием эффекта основа-

теля, как известно, является наличие различных мажорных по

частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных

изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в

частности, при ганглиозидозе GMI. Так, в Японии мажорными

при этом заболевании являются миссенс мутации I51T и R201C,

тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффек-

том основателя можно объяснить высокую частоту аспартилглю-

козаминурии в Финляндии, так как в 98% случаев у пациентов

финского происхождения заболевание обусловлено присутствием

одной и той же миссенс мутации C163S, резко уменьшающей ак-

тивность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что

эта мутация у больных находится в сильном неравновесном

сцеплении с другой миссенс мутацией в AGA-гене - R161Q, яв-

ляющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Невоз-

можно, однако, исключить возможность комбинированного влия-

ния этих двух мутаций на фенотип.

Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру

мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных бо-

лезней накопления как болезнь Тея-Сакса, Ниманна-Пика и бо-

лезнь Гоше. Прежде всего, эти заболевания особенно распрост-

ранены среди евреев-ашкенази, среди которых они встречаются

в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или

азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных му-

таций для всех трех заболеваний у 70 - 95% всех пациентов

еврейского происхождения скорее всего нельзя обьяснить толь-

ко эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное пре-

имущество гетерозигот, характер миграции, социальные и рели-

гиозные особенности, обусловливающие ассортативность образо-

вания супружеских пар - вот те факторы, которые, по всей ви-

димости, лежат в основе этих различий. В этой связи инте-

ресно отметить, что среди пациентов других национальностей

мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем

у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа B часто

встречается среди жителей стран, расположенных в западной

части Северной Африки. Однако, в 80% случаев заболевание

связано с делецией R608 в SMPD1-гене, которая не является

мажорной среди евреев-ашкенази.

На примере лизосомных болезней могут быть хорошо

прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими

особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных

вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, ли-

бо к синдрому Шейе. Разные миссенс мутации в гене NAGA при-

водят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки (Табл.

10.1.). Важное значение для анализа молекулярных основ пато-

генеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фе-

нотипической манифестацией (так называемые взрослые формы).

Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болез-

нях Тея-Сакса и галактосиалидозе. Очень интересен случай

различного фенотипического проявления на разном расовом ге-

нетческом фоне одной и той же мутации - мажорной 16-кб деле-

ции, обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни

Зандхоффа (McInnes et al.,1992; Sidransky et al.,1994). В

частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в ком-

паунде с миссенс мутацией P417L, описанной впервые в Японии

у пациента с подростковой формой заболевания, провлялась как

взрослая форма с очень мягким течением заболевания.

В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную

природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фе-

нотип. К примеру, при некоторых форм метахроматической лей-

кодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания

связана с существованем, так называемого, псевдодефицитного

аллеля ARSA-гена. Этот полиморфный аллель встречается в по-

пуляциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы

по нему состаляют 1 - 2% всего населения. Оказалось, что

псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух

мутаций в цис-положении. Одна из них - 3'-концевая ругуля-

торная мутация в первом сайте после стоп кодона, изменяет

сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс мутация в 6-м

экзоне, приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно

отметим, что для гена ARSA (также как и для IDUA-гена) обна-

ружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фиб-

робластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, разме-

ром 2.1 кб и 3.9 кб, соответственно. У гомозигот по псевдо-

дефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2.1 кб мРНК,

при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается.

Однако, при наличии S96F мутации в ARSA-гене на фоне псевдо-

дефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии.

В заключении раздела кратко рассмотрим состояние проб-

лемы генокоррекции лизосомных заболеваний. В литературе

отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях

программ генотерапевтического лечения этих заболеваний, од-

нако, по крайней мере, для некоторых лизосомных болезней та-

кие программы уже разработаны и утверждены (см.Главу IX,

Табл.9.2). Имеются сведения о положительных результатах та-

ких исследований на культурах мутантных клеток и на модель-

ных животных. Так, в опытах in vitro был осуществлен успеш-

ный ретровирусный перенос нормальной кДНК гена GBA в культу-

рах мутантных фибробластов (Sorge et al.,1987) и в культурах

клеток крови пациентов с болезнью Гоше (Fink et al., 1990),

в результате чего была достигнута коррекция глюкоцеребрози-

дазной активности. Такая же коррекция метаболическоих дефек-

тов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была

достигнута путем введения в соответствующие мутантные линии

клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS соответственно. При

этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретровирусной

трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной и

рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глю-

козамногликанов. Генокоррекция первичного биохимического де-

фекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) была получе-

на как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального

гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на

собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок

(бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появ-

лялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических

глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Введение этого же

гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к

длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосо-

мального накопления в печени и мозге и частичной коррекции

болезни у трансгенных животных (Wolf et al.,1992). В другом

эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные

фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имп-

лантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблю-

дали экспрессию введенного гена и полное исчезновение ли-

зосомальных отложений в печени и в мозге (Sly, 1993). Полу-

ченные результаты подтверждают принципиальную возможность

лечения, по крайней мере, некоторых лизосомных болезней с

помощью методов генной терапии.

Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически-

ми" мутациями.

Обнаруженный в 1991г. новый тип так называемых динами-

ческих мутаций и связанные с ними наследственные заболевания

частично рассматривались нами в Главе IV. Однако их уникаль-

ность, необычный механизм экспрессии, особенности наследова-

ния, быстрый рост нозологий, обусловленных подобными наруше-

ниями в последовательности ДНК, и, как оказалось, достаточно

широкая распространенность (см.Табл.9.2) делают целесообраз-

ным их более подробный анализ.

Как упоминалось, этот тип мутаций пока найден только у

человека и не зарегистрирован ни у одного вида млекопитающих

или других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды

и пр.). Суть мутаций заключается в нарастании числа триплет-

ных повторов, расположенных в регуляторной или в кодирующей,

а значит и в транслируемой части генов. Впервые такой тип

мутации был обнаружен при молекулярном анализе синдрома фра-

гильной (ломкой) Х-хромосомы, наследственная передача кото-

рой не подчинялась обычным менделевским законам. В дальней-

шем аналогочные динамические мутации были описаны и при 7

других наследственных заболеваниях, контролируемых генами,

расположенными на разных хромосомах - Таблица 10.2. Вместе с

тем, все нижеперечисленные нозологии имеют ряд общих призна-

ков, позволяющих объеденить их в одну самостоятельную груп-

пу. Прежде всего, для триплетных повторов, экспансия которых

блокирует функцию гена, характерен выраженный популяционный

полиморфизм, причем число аллелей может варьировать от еди-

ниц до нескольких десятков. Другой их особенностью является

доминантный тип наследования, характерный как для Х-сцеплен-

ных генов, так и для генов, находящихся на аутосомах. Осо-

бенностью практически всех болезней "экспансии" является

также эффект антиципации (ожидания), смысл которого заключа-

ется в нарастании тяжести симптомов заболевания в последую-

щих поколениях, что, как оказалось, является результатом на-

копления ("экспансии") исходного числа триплетов после того

как их количество возрстает больше нормального. Характерными

для этих нозологий являются и особенности их передачи по-

томству: для некоторых заболеваний типична передача по мате-

ринской (Fra-X, миотоническая дистрофия), а для других -

преимущественно по отцовской линии (хорея Гентингтона).

Практически для всех "динамических" мутаций характерно пора-

жение головного мозга и особенно подкорковых структур, при-

чем тяжесть заболевания и его начало четко коррелируют с

числом повторов. Молекулярный анализ этих генов позволяет

предполагать определенное сходство механизма экспансии трип-

летов, которая, по всей вероятности, происходит в митозе,

затрагивает чаще аллели с начально большим числом повторов,

при этом нередко сигналом экспансии является утрата негомо-

логичного триплета, в норме разделяюего цепочку монотонных

повторов. Вместе с тем, патогенетические механизмы проявле-

ния мутаций экспансии принципиально различны. В случае раз-

личных вариантов FRAX мутаций наблюдается блок экспрессии

соответствующих генов вследствие стабильного метилирования

области CpG островка в промоторной части генов. При миотони-

ческой дистрофии нарушение экспрессии, по-видимому связано с

ошибками взаимодествия транскрибируемой нити ДНК с нуклеосо-

мами. В случае остальных сугубо нейродегенеративных заболе-

ваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная мышечная ат-

рофия и др.) экспрессия гена не нарушена, однако, образую-

щийся белковый продукт с необычно длинной полиглутаминовой

цепочкой каким-то образом нарушает процессы нормального ме-

таболизма нервных клеток подкорковых отделов мозга.

Таким образом, причиной повреждающего действия одних

"динамических" мутаций является блок генной экспрессии, то

есть потеря функции (loss-of-function mutation), тогда как

другие мутации того же типа, связанные с нейродегенративными

заболеваниями, ведут к появлению белковых продуктов с ано-

мальными функциями ( мутации типа -gain-of-function). Инте-

ресно отметить, что помимо динамических мутаций для каждого

названного гена обнаружены единичные точковые мутации, число

которых крайне невелико. Для каждой болезни "экспансии" раз-

работан свой вариант диагностики, основанный на ПЦР. Ампли-

фикация области триплетных повторов и дальнейший электрофо-

ретический анализ синтезированных продуктов позволяет опре-

делить число повторов, то есть провести генотипирование ал-

лелей. Вместе с тем, при числе повторов более 200, амплифи-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41