Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)
p>каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. Приположительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и
процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать
нужные клоны.
Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг-
нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации
могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,
наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена
и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и
трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет
инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего
образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле-
точных протеаз.
Более совершенной является разработанная недавно техни-
ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные
по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе
ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и
прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в
нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо-
вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише-
ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы
(Рис.8.5). После трансфекции отбираются клетки позитивные по
HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких
клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич-
ная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертиро-
ванный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается
при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT ми-
ни-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в ко-
торый предварительно вносят интересующие исследователя мута-
ции. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие
ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирую-
щий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой
вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроен-
ной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента
исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с по-
мощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции
гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология
позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные,
заранее спланированные изменения, в том числе и специфичес-
кие мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях
у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить
более тонкое генетическое моделирование и исследовать осо-
бенности функции мутантного гена in vivo.
Для введения специфических мутаций в определенные экзо-
ны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Has-
ty et al., 1991). Перспективным также представляется исполь-
зование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные
кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомоло-
гичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие
конструкции легко вводить специфические мутации и затем ис-
пользовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных
животных 4.
Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых
произошла направленная модификация гена-мишени, в значитель-
ной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по
созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие
этапы этой программы, включающие получение химерных транс-
генных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров
(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и
селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах осо-
бей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложня-
ющим обстоятельством является то, что химерные животные не-
редко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же
может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутант-
ных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации
могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но
и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в прена-
тальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем
отбора и скрещивания гетерозигот.
Несмотря на огромные методические сложности и высокую
стоимость, направленное получение моделей наследственных бо-
лезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные
представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло-
гические процессы, развивающиеся в организме вследствие на-
рушений работы определенного гена, анализировать влияние
специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарс-
твенные препараты и испытывать различные терапевтические
подходы. Велика также роль генетических линий в разработке
методов генной терапии (см. Главу IX).
ГЛАВА IY.
ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК- ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
таций.
Каждый генетический локус характеризуется определенным
уровнем изменчивости, то есть присутствием различных аллелей
или вариантов последовательностей ДНК у разных индивидуумов.
Применительно к гену, аллели разделяются на две группы -
нормальные, или аллели дикого типа, при которых функция гена
не нарушена, и мутантные, приводящие к нарушению работы ге-
на. В любых популяциях и для любых генов аллели дикого типа
являются преобладающими. Под мутацией понимают все изменения
в последовательности ДНК, независимо от их локализации и
влияния на жизнеспособность особи. Таким образом, понятие
мутации является более широким по сравнению с понятием му-
тантного аллеля. Уместно, однако, заметить, что в научной
литературе сравнительно часто встречающиеся в популяциях ва-
рианты последовательностей генов, не приводящие к заметным
нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные
мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "му-
тантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.
Как упоминалось ранее, различные изменения в нуклеотид-
ной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут
по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает
никакого влияния на структуру и функцию соответствующего
белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приво-
дящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетическо-
го кода. Мутантные аллели, в свою очередь, могут быть под-
разделены на три класса: (1) мутации, ведущие к полной поте-
ре функции (loss-of-function), (2) мутации, сопровождающиеся
количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных
белковых продуктов и (3) доминантно-негативные мутации, из-
меняющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они
оказывают повреждающий эффект на жизнеспособность или функ-
ционирование экспрессирующих типов клеток (gain-of-function
мутации). Наибольшим повреждающим действием обладают мута-
ции, приводящие либо к образованию бессмысленного белка, ли-
бо к преждевременному окончанию его синтеза, то есть делеции
или инсерции, не кратные трем нуклеотидам и потому вызываю-
щие сдвиг рамки считывания, а также нонсенс мутации - замены
нуклеотидов, при которых образуются терминирующие стоп-кодо-
ны. Проявление таких мутаций зависит от их внутригенной ло-
кализации. Чем ближе мутации к 5' концу гена, то есть к на-
чалу транскрипции, тем короче их белковые продукты. Такие
абортивные (truncated) белки неспособны к модификациям и
быстро деградируют.
Фенотипическое проявление замен нуклеотидов в кодо-
нах, так нназываемых миссенс мутаций, зависит от природы
соответствующих аминокислотных замен в белке и от функцио-
нальной значимости того домена, в котором это произошло.
Так, замены аминокислот в активных центрах белков могут соп-
ровождаться полной потерей его функциональной активности,
тогда как даже значительно более серьезные нарушения в дру-
гих частях белка часто оказывают существенно меньшее влияние
на фенотип. Мутации на стыке экзонов и интронов (так называ-
емые сплайсинговые мутации) часто нарушают процессинг пер-
вичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо
неправильное вырезание соответствующей интронной области и
трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного
от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, ли-
бо вырезание экзонов и образование делетированного белка. В
обоих случаях сплайсинговые мутации, как правило , обуслав-
ливают тяжелое течение болезни. Нарушения в регуляторных об-
ластях генов сопровождаются количественными изменениями
соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функ-
циональной активности белка. Проявление таких мутаций опре-
деляется, в конечном счете, пороговым уровнем концентрации
белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило,
регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выра-
женным плейотропным (множественым) эффектом по сравнению с
мутациями структурных генов.
Относительно недавно выявлен новый класс так называемых
динамических мутаций, или мутаций экспансии, связанных с
нестабильностью числа тринуклеотидных повторов в функцио-
нально значимых частях генов. Многие тринуклеотидные повто-
ры, локализованные в транскрибируемых или регуляторных об-
ластях генов, характеризуются высоким уровнем популяционной
изменчивости, в пределах которого не наблюдается фенотипи-
ческих нарушений (Willems,1994). Болезнь развивается лишь
тогда, когда число повторов в этих сайтах превосходит опре-
деленный критический уровень. Наследование таких мутаций,
как правило, отличается от классического Менделевского ти-
па. Для них характерны: различная пенетрантность в сочетании
с неполным доминированием; геномный импринтинг (различия фе-
нотипических проявлений в зависимости от того, получена му-
тация от матери или от отца) и феномен антиципации - на-
растание тяжести проявления заболевания в последующих поко-
лениях (Willems,1994).
Классическим примером мутаций экспансии является синд-
ром ломкой Х-хромосомы (FraXA), обусловленный присутствием
удлиненных CCG повторов в 5'-нетранслируемой регуляторной
области FMR1-гена (Xq27.3). Аналогичные нестабильные повторы
обнаружены еще в трех ломких сайтах, причем два из них
(FraXE и FraXF) расположены на очень небольшом расстоянии
дистальнее FraXA. Во всех четырех случаях CCG-повторы лока-
лизованы вблизи от CpG островков, при этом увеличение числа
копий триплетов выше определенного порогового уровня сопро-
вождается гиперметилированием всей регуляторной GC-богатой
области, вследствие чего и происходит резкое снижение и
полное выключение транскрипционной активности - мутации по
типу " утраты функции" (loss-of-functions). Таким образом,
область CCG-повторов в этих локусах можно рассматривать, как
своеобразный cis-действующий элемент транскрипции (Willems,
1994, Mandel,1994).
Другой тип динамических мутаций описан для 6-ти раз-
личных тяжелых аутосомно-доминантных нейродегенеративных
расстройств (см. Главу X). Для всех этих заболеваний обнару-
жено присутствие удлиненных CAG-повторов в открытой рамке
считывания (ORF). Эти повторы транслируются в протяженные
полиглютаминовые треки, предположительно локализованные в
ДНК- связывающих доменах соответствующих белковых продуктов.
В результате белковые молекулы приобретают новые свойства,
нарушающие нормальные метаболические связи. Таким образом,
нестабильные CAG-повторы можно рассматривать, как
gain-of-function - мутации. Интенсивно обсуждается также
возможность участия амплификации CAG-повторов в формировании
предрасположенности к таким частым расстройствам центральной
нервной системы, как шизофрения и маниакально-депрессивный
психоз. Примером третьей группы болезней экспансии служит
миотоническая дистрофия. При этом заболевании огромные CTG
(или CAG) повторы локализованы в 3'-нетранслируемой области
гена. Они также рассматриваются, как факторы, нарушающие
нуклеосомную организацию гена и подавляющие его транскрипцию
Более подробно болезни экспансии рассмотрены в Главе X.
Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных
заболеваний.
Одним из важных обобщающих итогов молекулярно-генети-
ческих исследований моногенных болезней явилось доказа-
тельство их генетической гетерогенности. Последняя может
быть вызвана разными причинами. Прежде всего, оказалось, что
один и тот же биохимический эффект (фенотип) может быть
обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, мута-
ции одного и того же гена, как установлено, могут приводить
к совершенно разным клиническим проявлениям. Например, мута-
ции гена адренорецептора, сцепленого с Х-хромосомой, могут
быть причиной нейродегенеративного заболевания - болезни
Кеннеди, если они захватывают область тринуклеотидных повто-
ров (Глава X), и в то же время приводить к синдрому тестику-
лярной феминизации, то есть нарушениям половой дифференци-
ровки, если они затрагивают другие последовательности этого
же гена. Крайним выражением такой гетерогенности может слу-
жить пример с геном рецептора тирозинкиназы -RET, различные
мутации которого могут приводить к 4-м совершенно различным
наследственным синдромам, таким как семейная медуллярная
карцинома щитовидной железы, болезнь Гиршпрунга, множествен-
ная эндокринная неоплазия тип 2А (МЭН-2А) и тип 2B (МЭН-2B)
(Hayningen,1994). Подобные фенотипические разнообразия про-
явлений мутаций одного и того же гена получили название ал-
лельных серий. Термин используется уже около 20 лет для
описания групп из нескольких моногенных наследственных забо-
леваний, клинические проявления которых позволяют предпола-
гать их связь с разными генами, в то время как биохимические
и/или генетические исследования доказывают их аллельную при-
роду, то есть в основе их патогенеза лежат разные мутации
одного и того же гена.
В настоящее время известно более 100 таких болезней
(Romeo, McKusick, 1994). Для каждого заболевания из подобной
серии аллелизм мутаций уже доказан на молекулярном уровне.
Причины подобного фенотипического разнообразия могут быть
различными: (1) локализация мутантных аллелей в функциональ-
но разных доменах белка; (2) принципиально разный механизм
действия мутаций (loss-of-function, gain-of-function); (3)
присутствие в том же гене модифицирующего мутантного аллеля
или полиморфизма и (4) влияние генетического окружения на
проявление мутантного аллеля, то есть его взаимодействие с
определенными аллелями гена-модификатора или даже нескольки-
ми такими генами. Углубленный молекулярно-генетический ана-
лиз практически каждого наследственного заболевания указыва-
ет на его значительную генетическую гетерогенность, связан-
ную с различными мутациями гена. Некоторые примеры аллельных
серий и генетической гетерогенности заболеваний будут
рассмотрены более подробно в Главе X.
Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
Для практических целей и, главным образом, для чтения
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41