Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>ся в возможности селективной элиминации тех специфических

типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с

моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть

получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа-

щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий-

ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде-

ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива-

ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз-

вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной

гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая

система действует как очень точный скальпель.

Дальнейшая модификация метода заключается в использова-

нии для трансгеноза условно летального гена, каким является,

например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,

экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль-

но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно

вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик-

ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль-

ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи-

ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так-

же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью

этих клеток. Подобная методология используется также при

разработке генотерапевтических подходов для лечения некото-

рых ненаследственных, в частности онкологических заболева-

ний (см Главу IX).

Весьма многообещающим методом моделирования представля-

ется направленное выключение работы определенных генов путем

введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.

Такой подход был применен, в частности, при попытке модели-

рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен-

ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).

Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена

носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля-

ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.

Другой пример экспериментального моделирования основан

на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным

мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса

и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-

жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у

таких животных может происходить дифференцировка трансплан-

тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе-

ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов

животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с

нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,

имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк-

туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется

в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-

тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан-

тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф-

фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью

методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители-

альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали

трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не-

сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК

нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по-

добных моделей и возможность генетического манипулирования с

клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела-

ют этот подход весьма привлекательным для решения многих

экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде-

лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных

мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи-

вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.

Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-

ний животных.

Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле-

копитающих и современные достижения молекулярной генетики

позволяют осуществлять направленное получение генетических

моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи-

ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный

качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо-

жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани-

пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно

важными в этом отношении оказались два новых методических

подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных

клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в

полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии

культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио-

нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой

стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло-

нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно-

ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек-

ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте

геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности

ДНК в месте встраивания.

Конструированию генетических моделей должны предшество-

вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич-

ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото-

рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у

выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта

моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес-

кими возможностями экспериментального манипулирования с жи-

вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей

гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В

большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным

обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова-

ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене

предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть

способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб-

риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби-

нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного

переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры

эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от-

бором клонов со специфическими генетическими модификациями;

(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на

стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи-

мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-

сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;

(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)

инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).

Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ-

ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб-

риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;

Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры

этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле-

точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос-

тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном

слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф-

ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом

они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери

способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель

(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо-

гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-

нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре-

зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ-

ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского

генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по

генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч-

ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза-

висимым образом полученные в результате введения в одинако-

вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут

отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как

все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся

и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные

животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки

и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе-

редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую-

ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс-

миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по-

томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то

есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти-

пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис-

кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких

гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан-

ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том

случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном

состоянии у животных этого вида.

Возможность вести селекцию нужных мутантных или

трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка-

честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети-

ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра-

батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби-

рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем

использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.

Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни-

хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы

(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной

доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети-

ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-

фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло-

гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При

трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби-

нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде

кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин-

теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина

путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты

хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов

устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо-

жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе-

циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной

ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной

ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды

или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего

в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со-

общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых

произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут

образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418,

содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток

будут в этих условиях деградировать.

Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.

Наиболее важным шагом на пути искусственного получения

мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с

сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако,

случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их

общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются

попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в

них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы не-

которые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у чело-

века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации

генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые

направленная сайт-специфическая модификация была выполнена

также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше)

и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру-

ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че-

ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в

первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо-

ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном

на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован

в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.

При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер-

цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи-

цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).

В настоящее время предложено несколько вариантов для

направленного переноса неселектируемых генов за счет допол-

нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого

маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес-

сия происходит преимущественно при правильном встраивании

векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так,

маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК

плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться

только находясь под контролем какого-либо другого промотора

хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна

произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.

При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет

Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к

резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо-

логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На

этом же принципе основано использование генетических конс-

трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности

в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов

среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза-

ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос-

ледовательности, расположенный вне направленно переносимого

участка экзогенной ДНК.

Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме-

тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция

экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где

встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.

Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными

последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК

плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный

вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции

такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина-

ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при

негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в

неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо-

герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги-

белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу

(Рис.8.3).

Отбор клеток с модифицированным геном также может про-

изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо

маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для

амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-

гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди-

фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе-

мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать

присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди

50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41