Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>этими группами и реконструировать их филогенетические отно-

шения (Cavalli-Sforza,Piazza,1993). Одним из практических

следствий этих исследований является возможность прогнозиро-

вать наиболее вероятные мутации в различных генах у пациен-

тов разного этнического происхождения, что приводит к суже-

нию спектра поиска специфических мутаций. Особый интерес в

этом смысле представляют наиболее распространенные мутации

(например delF508 при муковисцидозе; R408W - при фенилкето-

нурии и многие другие). Для профилактики наследственных за-

болеваний необходима разработка эффективных и простых мето-

дов молекулярной диагностики таких мутаций как у больных,

так и у гетерозиготных носителей с целью проведения скрини-

рующих программ среди населения и выявления максимально воз-

можного числа семей с повышенным риском рождения больного

ребенка.

ГЛАВА VII.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГ-

НОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-

ностики.

Локализация и клонирование кДНК-овых последовательнос-

тей генов открывают принципиально новые возможности диагнос-

тики наследственных заболеваний, основанные на исследовании

мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предпо-

лагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций.

Это в равной мере относится и к пренатальной диагностике,

которая может быть проведена с использованием молекулярных

методов анализа на самых ранних стадиях развития плода

(см.7.5). Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до

появления каких-либо клинических или биохимических симптомов

болезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет вы-

работать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая

терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носите-

лей в семьях высокого риска, что является важным фактором

профилактики наследственных болезней. Решающими преимущест-

вами молекулярной диагностики являются её универсальность,

возможность использовать для анализа любые ДН-содержащие

клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на лю-

бых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.

Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагнос-

тику мононогенных наследственных болезней. В общем случае,

использование прямых методов диагностики возможно лишь для

клонированных генов с известной нуклеотидной последователь-

ностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предвари-

тельное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В

случае прямой диагностики обьектом молекулярного анализа яв-

ляется сам ген, точнее мутации этого гена, идентификация ко-

торых и составляет основную задачу исследования. Такой под-

ход особенно эффективен при наличии точной информации о при-

роде, частоте и локализации наиболее распространенных (доми-

нирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также

о наличии в них особенно легко мутирующих "горячих" точек. К

таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при

муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна,

мутация R408W при фенилкетонурии, инверсионная мутация при

гемофилии А, протяженная делеция при адрено-генитальном

синдроме, экспансии триплетных повторов в случае "динамичес-

ких" мутаций при синдроме ломкой X-хромосомы и при ряде дру-

гих нейродегенеративных заболеваний (см. Главы IV и X). Ме-

тоды, используемые для направленного поиска этих мутаций,

подробно рассмотрены в Главе IV. В ряде случаев (муковисци-

доз, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы

удалось автоматизировать, что позволяет одноверменно тести-

ровать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций.

При этом появляется реальная возможность выявлять свыше

95-98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и эко-

номически оправданным скринирование всей популяции отдельных

стран на выявление мутантных особей для последующей органи-

зации эффективных профилактических мероприятий, направленных

на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы

по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Запад-

ной Европы (Великобритания, Дания, Франция) и Северной Аме-

рики.

Главное преимущество прямого метода - это высокая, до-

ходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходи-

мости анализа всей семьи на предмет её информативности

(см.ниже). Последнее обстоятельство особенно важно для про-

ведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных

наследственных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшен-

на, гемофилия А и др). Такие семьи нередко обращаются за ме-

дико-генетической помощью уже после того как больной ребенок

умер. Так, по нашим наблюдениям до 80% семей с высоким рис-

ком муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородо-

вой диагностики уже после смерти больного ребенка (Baranov

et al., 1992).

Однако, существует огромное количество наследственных

болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено ма-

жорных мутаций в исследуемых популяциях. И даже во всех тех

случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними, опи-

саны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных

случаев), так называемые минорные мутации. Кроме того, всег-

да сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвест-

ных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей

прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой

его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевид-

ных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти

трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых

(косвенных) методов молекулярной диагностики.

Этот исторически более ранний подход основан на исполь-

зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью

которых проводится идентификации мутантных хромосом (точнее

хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, то

есть у родителей больного и его ближайших родственников. В

настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики

принципиально возможны практически для всех моногенных забо-

леваний с известной локализацией контролирующего гена, для

каждого из которых уже разработана удобная система вне- и

внутригенных полиморфных индексных маркеров (см.Главу III).

Более того, косвенные методы молекулярной диагностики

пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не иденти-

фицированы и мутации не известны. Единственным и непременным

условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрик-

ции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в

непосредственной близости от мутантного гена или, что еще

лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих

полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена

и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние

иследования непрямым методом проводились почти исключительно

с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель-

ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%,

а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя-

ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова-

тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи-

телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной

мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой

молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно-

го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае

ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения

числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ-

ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во

всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали-

зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер

может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг-

ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион-

ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой

стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.

Все эти недостатки могут быть устранены при использова-

нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан-

демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов

(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные

паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро-

вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.

Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось

(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному

и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих

генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге-

нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук-

леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование,

практически, любого картированного гена. Особенную диагнос-

тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко-

торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными

аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди-

агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные

полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное

неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля-

ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго-

щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных

мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их

применение позволяет маркировать, то есть сделать информа-

тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи

высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос-

тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма-

териала .

Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его

родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке-

ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел

7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны-

ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных

методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка-

честве обязательного предварительного этапа исследование

частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали-

зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите-

лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и

неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му-

тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по-

мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР

(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении

исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто-

ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности

районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты,

для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).

Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле-

дования.

Напомним, что значительное число моногенных заболеваний

наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто-

сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо-

зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы,

но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или

нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли-

тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться

из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе

наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не

доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни-

женные потенции к размножению, редко удается выявить больных

родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение

составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который

возникает либо за счет высокой частоты близкородственных

браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых

изолированных популяций ограниченной численности. Больные

дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро-

дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и

того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та-

кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто-

рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред-

шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе

риска относительно невелика, а риск повторного рождения в

них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного

возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен-

ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в

Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль-

чики, тогда как носителями являются девочки.

Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из

которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто-

сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко-

ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо-

сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо-

ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола

по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят

к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе-

ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо-

нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре-

версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,

1993). Практически важно, что присутствие даже небольшого

околоцентромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при

кариотипе XX является безусловным показанием для удаления

зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой веро-

ятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному

перерождению - гонадобластоме (Giquel et al., 1992). В отли-

чие от Y-хромосомы, большая по размеру X-хромосома человека

несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже

идентифицированы (см. Главу III).

Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляют-

ся, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки мо-

гут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации.

Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их

отец, а мать является носительницей мутации и передала доче-

ри свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров,

можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете,

которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболева-

ния у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть

следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одно-

го из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромо-

сом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у

мальчиков, мутации Х-сцепленных генов будут находиться в ге-

мизиготном состоянии

При доминантном наследовании для развития болезни дос-

таточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероят-

ностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен.

Очень редко больные дети с доминантным типом наследования

могут родиться и у здоровых родителей в результате мутирова-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41