Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)
p>риотические клетки, конструируют на основе прокариотическихили дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в
клетках эукариот, а также используют различные эукариоти-
ческие вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аде-
ноассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка-
честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последова-
тельности, ответственные за начало репликации. Введение век-
торов в эукариотические клетки часто осуществляют путем
ко-трансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и
сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, вве-
денные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение
нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул -
эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК
в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последователь-
ности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и насле-
дуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).
Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со-
держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихро-
мосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial
yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векто-
ров, содержащих в своем составе известные центромерные и те-
ломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые
для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Та-
кие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК
размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар осно-
ваний.
Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки
хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как
уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные
клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осущест-
вляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс
введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется
трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий,
облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через
клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости
мембран используют два разных подхода. В первом случае про-
водят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными
растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных
мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,
DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае
используют краткосрочное физическое воздействие на клетки
для создания в мембранах микропор, проходимых для макромоле-
кул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным
электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и
т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетичес-
кой трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Воп-
росам молекулярного клонирования также посвящена обширная
литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Мани-
атис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.
Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи-
кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для
использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником
этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро-
ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или
скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в
зависимости от специфических особенностей этих последова-
тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных
перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате
рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде-
ленной из какого-либо специфического источника. В зависи-
мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые
библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис-
пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от-
дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК
-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль-
тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-
ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об-
ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её
разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.
Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-
тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте-
ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге-
нов, но также несмысловые внутригенные последовательности -
интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-
рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки
состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-
иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-
ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч
пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-
щихся последовательностей геномной ДНК человека получается
после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или
Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-
личество клонов с различными инсертированными фрагментами
ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-
мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в
одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные
библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -
10!6 различных клонов.
Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или
космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче
хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-
отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на
основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая
способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много
удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут
быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-
ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто
используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-
ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не
вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для
создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,
используется технология искусственных дрожжевых хромосом
-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)
фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-
нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-
ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных
ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или
космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на
фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными
ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека
сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).
Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают
на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-
зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-
зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.
Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие
чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры
и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят
их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-
ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-
тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-
тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на
рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-
зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК
последовательности, комплементарные зонду, или специфические
антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных
культурах производят именно в тех местах, где произошло по-
темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,
отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-
нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и
субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать
большие количества этой ДНК.
1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного
ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-
ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-
ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-
ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул
ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,
однако, определение нуклеотидной последовательности протя-
женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-
дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-
ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -
метод Сэнджера. В первом случае используют химическое
расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют
нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез
на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так
как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-
го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-
руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют
секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-
нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-
ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-
ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного
участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную
смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,
один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-
рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют
один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов
- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на
место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.
Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-
щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и
тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-
ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-
ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-
рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов
может быть определен, а значит и определена локализация ди-
дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов
в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем
геле может быть определена первичная последовательность все-
го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте
этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.
Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК
в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет
назад оценивалась в 1$.
В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-
варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных
на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых
участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-
ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-
залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс
одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-
шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология
автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным
для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-
лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-
нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-
ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается
автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение
в реализации программы Геном человека. По последним данным,
разработка автоматических секвенаторов позволила снизить
стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-
ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах
фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-
но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.
В последние годы активно разрабатываются принципиально
новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-
ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-
ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой
последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-
ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский
и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для
этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых
пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-
да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-
рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-
деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество
возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-
емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют
с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется
только с теми октануклеотидами, последовательности которых
комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-
бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-
дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной
компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-
тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод
позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет
автоматизации процесса.
1.7 Полимеразная цепная реакция.
До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-
рование являлись единственными способами поиска и выделения
специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей
ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о
большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи-
альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые
фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш-
ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих
последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так
как определяются наличием соответствующих рестрикционных
сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе-
ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое
количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК
(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК
обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока-
зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях
и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед-
ленного использования собранной крови для выделения ДНК или
хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова-
ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи-
вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент-
ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не-
обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив-
ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны
быть использованы в течение очень короткого периода после их
приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41