Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали-

чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно

лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не-

обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд-

линяет время получения результатов, что также ограничивает

использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди-

агностики плода, специфика которой во многом определяется

сроком беременности.

Предложенный в 1983г. американским исследователем

Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской

премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -

метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным

открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или

специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте-

зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной

от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,

реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые

образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук-

леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,

так как специфический выбор этого участка осуществляют путем

гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-

ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями

ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-

концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой

нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между

праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка-

честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип

ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов

про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери-

альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для

проведения специфической амплификации не требуется больших

количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной

молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в

значительной мере связан с использованием в качестве фермен-

та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,

выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по-

тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,

1987).

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока-

зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая

матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг-

ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю-

щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно

проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации

или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,

комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-

шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за

счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50

С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго

специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе-

ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С,

начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого

участка, образованного праймерами. Затем при нагревании

раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух-

нитевой участок между матричными и вновь синтезированными

молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле

олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за-

тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку-

лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу-

чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного

режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро-

ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер

вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного

нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат-

ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для

амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации

в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из

процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой

реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят-

ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится

от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синте-

зированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР

обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого

специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.

Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и

выбирать оптимальные временные и температурные параметры для

каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы

возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень

проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме-

ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля-

ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают

небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст-

вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной

смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую

программу циклической смены температуры и длительности каж-

дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,

составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального

режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи-

цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для

каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,

длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич-

ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой

термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и

состав амплификационной смеси могут существенно варьировать

и зачастую подбираются эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места

локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а

также изучать наличие любых других специфических особен-

ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на

основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици-

руемого участка. Разработаны различные варианты автомати-

ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото-

рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации

специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри-

дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со-

держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме-

чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли-

чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные

органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг-

леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не

препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве

источника матричной ДНК может быть использован любой, даже

деструктурированный биологический материал, сохранивший в

своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных

молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен-

ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна

крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины

хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль-

туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не

прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге-

нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен-

ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши-

еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более

подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде

специальных руководств и инструкций.

Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь-

зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции

или от характера последующего молекулярного анализа амплифи-

катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа-

щих различные повторяющиеся последовательности или необычные

структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич-

ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в

два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором

этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,

продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих

случаях для повышения специфичности праймирования используют

систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,

то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают

последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в

первом раунде участка ДНК.

В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,

то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-

ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в

реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас-

луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.

На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии

генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,

что реакцию амплификации можно проводить не только в раство-

рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при

этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты

амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар-

ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase

reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи-

кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В

последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо-

вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра-

зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ-

ального температурного режима полимеразных циклов), возможно

проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В

частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со

вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et

al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ-

но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,

так как этот метод по праву стал один из основных в молеку-

лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;

Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).

Возможность очень точного и специфичного выбора участ-

ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо-

лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-

лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную

ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле-

те в виде красной полосы после электрофоретического концент-

рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.

Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот

гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.

При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках

ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли-

чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в

соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем

электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в

размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет

делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат-

ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых

молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также

структурные изменения в дуплексах между нормальными и му-

тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на-

конец, возможно определение полной нуклеотидной последова-

тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му-

таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).

Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму-

щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-

чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более

подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью

ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ

определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом

отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу-

тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.

Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и

клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова-

ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству-

ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо-

ванием ПЦР.

ГЛАВА VI.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.

Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор

адекватных биологических моделей.

Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото-

рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда-

ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге-

нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на

этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные

этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо-

вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции

активности генов в нормальных клетках, оценку клинического

выражения различных типов нарушений гена, выявление первич-

ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку-

лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.

Естественно, что в различных тканях организма

экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.

Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо-

зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе-

чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По

весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че-

ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках

печени - основной биохимической лаборатории организма - око-

ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,

1977). Это означает, что в различных соматических клетках

эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,

1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо-

дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про-

цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях

организма происходит избирательная активация многих других

специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает

значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско-

рости их синтеза.

Контроль генной активности осуществляется за счет диф-

ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд-

рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной

трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным

результатом которой является синтез функционально активного

белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной

активности, но и полноценность всех последующих этапов,

включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность

к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и

корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре-

шающее значение для успешного анализа всего этого сложного

комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по-

иск и целенаправленное конструирование которых представляет

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41