Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)
p>¦
Методы ¦
Трансдукция¦
Иинтеграция
¦Экспрессия
¦+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦
¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦
¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦
¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦
¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦
¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦
¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦
¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦
¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦
L-------------------+------------+-------------+-------------
Как следует из представленных данных, введение чужерод-
ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по-
мощи некоторых физических способов доставки (электропоации,
бомбардировки частицами золота), так и, практически, при
всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью
рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном
клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет-
ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих
необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства-
ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра-
вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге-
на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические
конструкции, включающие вирусные последовательности способны
к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс-
прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи,
что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола-
гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны
на применении ретровирусных векторов.
Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,
Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от-
сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%)
трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо-
кой пакующей способностью (включение генетической конструк-
ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не-
интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно
важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он-
когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек-
тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на
пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).
Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
шенствование методов трансформации клеток
человека.
9.4.1. Основные векторные системы.
В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.
Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи-
муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина-
лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес-
кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую
последовательность определенного гена, инсертированную в
экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием
сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от
многих параметров, главным из которых является необходимый
уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со-
держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе-
та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду-
цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию
либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для
генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь-
ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген
(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про-
изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре-
дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз-
мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции
удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по-
лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак-
териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не
способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.
Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в
клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус-
ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение
через клеточные мембраны.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в
клетки эукариот.
Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно
проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных
клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.
Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу-
жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где
обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только
небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает
в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо-
жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает-
ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы,
в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и
низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1
года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб-
риллах (Hansen et al.,1991).
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в
ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции
(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания
трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук-
леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи
электропорации (кратковременного воздействия сильным элект-
рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми
или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод-
ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди-
ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для
клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь
метод бомбардировки, который при наличии специального генно-
го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et
al., 1990).
Для повышения эффективности переноса обычно используют
системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо-
действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег-
чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс-
твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой
доставки является система кальций-фосфатной копреципитации,
широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более
сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет
собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий
создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс-
трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка-
честве лигандов используются специфические белки, такие как
трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован-
ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую-
щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген-
ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную
доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри-
мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и
эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно
присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК
катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).
Важным компонентом системы является аденовирус или его
N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу-
зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн-
досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес-
ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов
обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс-
трукций, их несомненную перспективность для генной терапии
in vivo (Hodgson, 1995).
Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и
физико-химического подхода при конструировании систем для
переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно-
вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции
эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа-
га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер-
тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили-
зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз-
мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген
оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую
какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной
поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес-
печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью
были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю-
щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после-
довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель-
ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что
во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер-
нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно
функционирует.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, со-
держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен
при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в
этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает
прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде-
альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре-
цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг-
менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые
находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб-
ная система разработана для рецептор-опосредованного генного
переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова-
нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли-
мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор
транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет-
ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо-
цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции
эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли-
зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной
ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под-
ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы
клеток.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег-
радации лизосомальными ферментами достигаются при использо-
вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла-
дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью
сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в
этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли-
пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные
нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности
таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица-
тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание
чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен-
но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф-
фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь-
ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть
осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта-
мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота
трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом
получена в экспериментах на культурах клеток при использова-
нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим
пептидом грамицидином S.
Особенно перспективными в последнее время представляют-
ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными
антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы)
либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе-
чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет-
ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе-
реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты
линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До-
казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге-
на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты
получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных
по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи-
вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе-
ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен-
ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового
комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро-
вень холестерина в крови животных устойчиво понижался.
Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на
основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они
лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным
векторным системам. Вместе с тем, до сих пор не решена проб-
лема низкой частоты трансформации клеток при липосомном пе-
реносе. Это обстоятельство существенно ограничивает примене-
ние липосом в генной терапии (Crystal, 1995). Тем ни менее,
в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи
генетической информации в клетки эукариот с использованием в
качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков,
а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в
одной системе совместить преимущества физико-химических ме-
тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет
один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап-
равлений в трансфекции эукариотических клеток.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
Конструирование векторов на базе вирусов представляет
собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера-
пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно-
го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41
