Быстрый поиск

Научная работа: Структура и регуляция активности ферментов подсемейства 3А цитохрома Р-450

Относительно взрослых = 100 %.

CBZ-E = карбамазепин-10,11-эпоксид;

DHEA = дегидроэпиандростерон;

DHEA-S = дегидроэпиандростерон 3-сульфат;

IQ = гетероциклический амин: 2-амино-3-диметил-имидазо[4.5-/]квинидин;

MelQ = гетероциклический амин :2-амино-3.4-диметил-имидазо[4,5-]квинидин;

3MM = 3-метокси-меторфан;

ND = не определяется; + к указаны увиличение уровней экспрессии; - нет указаных уровни экспресии; ? указанная экспрессия не известна.

Таблица 2 - Сравнительная характеристика основных CYP3A изоформ

Изоформа Р-450	Локализация	Ген	Процент от общего содержания	каталитическая активность, комментарии	Ссылки
CYP3A4	мидзональные и центролобулярные регионы печени и энтероциты тонкой кишки (40 % от общего содержания), а так же CYP3A4 экспрессируется в пищеводе, двенадцатиперстной кишке, и ободочной кишке	7 q22.1. Ген разделен на 13 экзонов и 12 интронов с длиной приблизительно 27КБ.	30-40	активность тестостерон p-гидроксилазы в микросомах печени человека, представляет главным образом активность CYP3A4, CYP3A4 также метаболизирует прокарциногены, например стеригматоцистин и афлатоксин В1. CYP3A активность немного выше у особей женского пола. Хотя менструальная фаза цикла не влияет на CYP3A4 активность.	23,151, 48, 26, 32.
CYP3A5	В печени- см. выше +CYP3A5, кажется, основная изоформа CYP3A экспрессирующаяся в желудке и пищеводе, а так же нисходящих отделах кишечника, почке, легких, крови (нейтрофилах и B лимфоцитах) и гипофизе (CYP3A5 mRNA и белок были обнаружены в человеческом гипофизе и расположены в клетках, продуцирующих гормон роста), а также незначительные количества в экстрагепатической эмбриональной и плодной ткани	На 83 %, гомологичен к CYP3A4	10-30 (до 74 %) в печени взрослых организмов	скорость образования 1-гирокси-мидазолама значительно выше с CYP3A5, формирование 4-гидрокси-мидазолама с CYP3A4 и CYP3A5 подобна, к эритромицину и этилморфину в 6 раз выше, чем у 3A4. Формирование карбамазепин-10,11 -эпоксида и 2-сулфамойлацетилфенола (SMAP) из зонисамида, катализируемого CYP3A5 составляет приблизительно 33 % и 10 %, по сравнению с CYP3A4. активно метаболизирует эстрадиол, дегидроэпиандростерон 3-сульфат и кортизол.	56,62,63,64,6,15 34,68 311 13, 23 34 32, 33.
CYP3A7	CYP3A7 является основной изоформой в печени эмбрионов, детей и новорожденных, хотя он присутствует и в печени взрослых но в меньшем колличестве, чем CYP3A4, CYP3A7 составляет приблизительно 32 % общего количества CYP содержание в плодной печени, незначительные количества в экстрагепатической эмбриональной и плодной ткани, Плацентарное и внутриматочное содержание CYP3A7, кажется, увеличивается знчительно от первого ко второму триместру беременности	Ген на 90% гомологичен 3А4	32	Формирование 1-гидрокси-мидазолама и карбомазепина-10,11-эпоксида незначительно по сравнению с CYP3A4, Метаболизм зонисамида CYP3A7 составлял 70 % от уровня CYP3A4. биотрансформация цизаприда до норцизаприда или его метаболитов с 2 первичными гидроксилированными кольцамим CYP3A7гораздо (в 10 раз) выше, чем наблюдаемое у CYP3A4, CYP3A7 катализирует 16o-гидроксилирование дегидроэпиандростерон 3-сульфат, что является физиологически важной реакцией для формирования эстриола в период беременности, с более высокой афинитивностью и максимальной скоростью чем CYP3A4. CYP3A7 очень мало вовлечен в 6p-гидроксилирование тестостерона, CYP3A7 способен метаболизировать такие токсические вещества, как например вфлатоксин Bl	18,19,36, 4,37

Множественные формы CYP3A присутствуют в печени крыс и мышей, одна изоформа обнаружена у кроликов, у человека были идентифицированы четыре CYP3A гена [Gonzalez и другие, 1993; Domanski и другие, 2001]. CYP3A гены кодируют наиболее распространенные CYP ферменты у людей, включая CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, и CYP3A43 [Wildt и другие, 1999; Gellner и другие, 2001]. Считается, что CYP3A4 является преобладающей формой в печени взрослого человека. CYP3A5 является полиморфной формой, чье присутствие в печени взрослого человека выражено переменной степенью. CYP3A5, как полагают, присутствует в печени, приблизительно у 20 % европейцев, однако последние исследования свидетельствуют о том, что, CYP3A5 экспрессируется и в печени более чем у 50 % негров [Lown и другие, 1994; Wildt и другие., 1999; Wandel и другие., 2000; Kuehl и другие., 2001] CYP3A4 и CYP3A5 распределены в множественных тканях, включая не только печень, но также кишечник и почки [Thummel и Wilkinson, 1998; Guengerich, 1999]. CYP3A7 - изоформа, найденная в тканях кишечника, репродуктивных органах, и печени младенцев, представлена также и в печени некоторых взрослых людей [Kitada и другие, 1985; Schuetz и другие., 1994]. Недавно был идентифицирован новый член семейства CYP3A (CYP3A43) - CYP3A43 mRNA найдена в основном в простате взрослого человека, хотя также представлены и в других тканях, включая печень, где индуцируется рифампицином [Gellner и другие, 2001] Westlind и другие. (2001) утверждают, что уровни CYP3A колеблются в печени на протяжении жизни индивидуума [Shimada и другие., 1994; Oesterheld, 1998]

Еще начальные фармакологические исследования продемонстрировали индукцию CYP3A глюкокортикоидами и, как это ни парадоксально, антиглоюкокортикоидами, что привело к идее существования неклассического глюкокортикоид-рецепторного механизма была и в итоге - к идентификации уникального представителя ядерного семейства рецепторов, прегнан X рецептора (PXR; NR1I2). Становилось все более и более очевидно, что PXR, также как другие ядерные рецепторы, посредник в процессе индукции CYP3A, где играет сложную роль, включая индуцибельность структурно разнообразными составами и обладает поразительными внутривидовыми различиями в индукционных профилях. Понимание значения роли ядерных рецепторов в регуляции экспрессии CYP3A и других генов P450 семейства предполагает дальнейшее определение физиологически функциональных и внутривидовых различий CYP3A в состоянии здоровья и болезни у человека.

Прегнан X рецептор (PXR)- представитель суперсемейства ядерных рецепторов, который появился в связи с развитием протекции организма от токсических химических веществ. PXR активируется структурно разнообразным спектром ксенобиотиков, включая широко используемые лекарственные препараты. Различные липофильные составы, продукты жизнедеятельности организма, такие как, желчные кислоты и стероиды, также активизируют PXR. PXR стимулирует транскрипцию цитохрома P450 3A монооксигеназ и других генов, вовлеченные в детоксикацию и элиминацию потенциально токсических веществ. Исследования PXR активации имеют важное значение для проектирования будущих лекарственных препаратов по двум причинам: с одной стороны, они могут использоваться, для определения возможностей отдельного лекарственного средства индуцировать экспрессию CYP3A гена и его взаимодействия с другими лекарственными препаратами. С другой стороны, PXR агонисты могут оказаться полезными в лечении заболеваний, при которых присходит аккумуляция токсических метаболитов, например холестатический синдром печени.

PXR включает стероид, ретиноид и рецепторы гормона щитовидной железы. Члены данного семейства функционируют как лиганд-активизируемые факторы транскрипции и играют основную роль в почти каждом аспекте развития индивидуума, а так же в физиологии взрослого организма. Члены семейства имеют общую структуру домена, которая включает высококонсервативную DNA, связанную с доменом (DBD) двумя “цинковыми пальцами”. DBD является рецептором-мишенью для коротких отрезков DNA (так называемых элементов ответа) в регуляторных областях целевых генов. Карбокси-терминалый регион ядерных рецепторов включает сохраненный лигандсвязующий домен (LBD), который служит сайтом состыковки лигандов, а также содержит мотивы димеризации и домены активации транскрипции (активатор функции - 2 (AF-2) геликса). Прикрепление лиганда к LBD заканчивается конформационным изменением в AF-2 геликсе, которое позволяет ядерному рецептору взаимодействовать с акцессорными белками и активизировать экспрессию целевых генов [48, 57, 58] [Bryan Goodwin1, Matthew R. Redinbo2, and Steven A. Kliewer , Regulation of CYP3A gene transcription by the PXR,Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. 42:1-23.].

Кульминацией вышеуказанных исследований можно считать признание того, что ядерные рецепторы подобные охарактеризованным для стероидных гормонов являются средствами индукции CYP3A. Таким образом, обширные данные, накопленные в процессе изучения этой группы физиологических лиганд-активируемых факторов транскрипции могут теперь быть расширены на всю систему метаболизма лекарственных средств.

Имеется большое количество факторов, способных воздействовать на токсичность и биотрансформацию лекарственных средств. Они обычно классифицируются на генетические и не-генетические, а также факторы окружающей среды. В последней категории, химическая экспозиция, в случае назначения лекарственных препаратов, профессиональные вредности на рабочем месте или загрязнение окружающей среды, воздуха и воды, ведет или к индукции или к ингибированию токсичности и метаболизма химических веществ.

Индукция определена как увеличение количества и активности метаболизирующего препарат фермента (DME), главным образом цитохромом P450 семейств от 1 до 4. Это длительное (часы и дни) последствие экспозиции химическим веществом.

Ингибирование ферментов P450 означает любое снижение уровня метаболизма специфического ксенобиотика другим ксенобиотиком, за счет одновременного присутствия в активном сайте фермента. В CYP3A семействе наблюдается также, активация P450 фермента аллокринными процессами.

Итак, классическое определение индукции - de novo синтез новых молекул фермента в результате увеличения транскрипции его гена после стимуляции соответствующим химическим сигналом.

Интересным можно считать сообщение о том, что гормон роста и трийодтиронин регулируют гидроксилирование стероидов цитохромом P-450 (CYP) 3A изоформой, которая конститутивно экспрессируются главным образом в перивенозных областях печени. Сравнивая лизаты клеток, полученные от перипортальных и перивенозных ацинарных областей наблюдалось увеличение CYP3A экспрессии после гипофизэктомии, что происходило главным образом благодаря увеличению экспрессии в обычно малоактивной перипортальной области. Этот эффект был особенно сильно выражен у особей женского пола. Прием гормона роста восстанавливал перивенозный уровень экспрессии, что было подтверждено иммуногистохимическим анализом секций печени. Анализ перипортальных и перивенозных mRNA обратно транскриптазной PCR демонстрирует, что у мужчин изменения CYP3A2 mRNA происходят паралельно с изменениями на белковом уровне. У женщин, CYP3A2 mRNA был обнаружен только после гипофизэктомии, поэтому казалось, что зональные белковые изменения предшествуют изменениям уровням CYP3A1 mRNA. Применение животными с гипофизэктомией трийодтиронина также подавляло экспрессию CYP3A, как у самцов, так и у самок.

Однако, это произходило почти исключительно в перипортальных областях, что определялось и на белковом уровне, методами иммуноблоттинга и иммуногистохимически, а так же на CYP3A1 и 3A2 mRNA уровнях. Эти результаты указывают на то, что гормон роста и гормон щитовидной железы регулируют экспрессию CYP3A генов зоно- специфически, подавляя их транскрипцию в перипортальных областях печени. [Oinonen T, Lindros KO. Hormonal regulation of the zonated expression of cytochrome P-450 3A in rat liver.Biochem. J. (1995) 309, (55–61) (Printed in Great Britain)] Известно, что большинство взаимодействий лекарственных средств, посредством CYP3A - результат или индукции или ингибирования этого фермента [241]. CYP3A4 активность может быть индуцирована in vitro и in vivo кортикостероидами (например дексаметазоном), противосудорожными средствами (например фенилэтилбарбитуровая кислота, фенитоин, карбамазепин) и некоторыми антибиотиками например рифампицин, рифапентин (рифампицин стимулирует 7-этоксикумарин O-деэтилирование (ECOD) активность в микросомах человеческих легкого. Однако многие известные индукторы CYP3A4, такие как дексаметазон, рифампицин или фенилэтилбарбитуровая кислота, не индуцируют CYP3A5 активность in vitro. Некоторые индукторы, однако, увеличивают в печени CYP3A белковые уровни у животных при помощи стабилизации. Такая посттранскрипционная регуляция сначала демонстрировалось для тролеандомицина и других антибиотиков с макроциклическим лактонным кольцом, которые образуют устойчивые комплексы с ферментом. Механизм, благодаря которому это взаимодействие стабилизирует CYP3A относительно последующей деградации, неясен, но может быть связано с процессом цАМФ-зависимого фосфорилирования , который принимает участие в белковой денатурации (159)[Thummel K.E., In vitro and in vivo drug interactions involving human CYP3A.,Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998. 38:389-430]

В современных изучениях, использующих субстраты, связанные в активном гомологичном сайте CYP3A4 и моделированные подобно бактериальному CYPBM-3, было доказано, что водородная связь большинства субстратов с Asn74 остатком CYP3A4 происходит часто наряду с составляющей Phe72 [Lewis DFV, Eddershaw PJ, Goldfarb PS and Tarbit MH (1996) Molecular modelling of CYP3A4 from an alignment with CYP102: Identifcation of key interactions between putative active site residues and CYP3A- specific chemicals. Xenobiotica 10: 1067-1086.; Tomlinson ES, Lewis DFV, Maggs JL, Kroemer HK, Park BK and Back DJ (1997) In vitro metabolism of dexamethasone (DEX) in human liver and kidney: The involvement of CYP3A4 and CYP17 (17,20 LYASE) and molecular modelling studies. Biochem Pharmacol 54: 605-611; Lewis DFV and Lake BG (1998) Molecular modelling and quantitative structure-activity relationship studies on the interaction of omeprazole with cytochrome P450 isozymes. Toxicology 125: 31-44] . Точно так же водородная связь с Asn74, кажется, происходит с ингибиторами подобными кетоконазолу и гестодену [Lewis DFV, Eddershaw PJ, Goldfarb PS and Tarbit MH (1996) Molecular modelling of CYP3A4 from an alignment with CYP102: Identifcation of key interactions between putative active site residues and CYP3A- specific chemicals. Xenobiotica 10: 1067-1086.]. Кроме того, Льюис и др. [Lewis DFV, Eddershaw PJ, Goldfarb PS and Tarbit MH (1996) Molecular modelling of CYP3A4 from an alignment with CYP102: Identifcation of key interactions between putative active site residues and CYP3A- specific chemicals. Xenobiotica 10: 1067-1086.] утверждают, что предполагаемые структурные требования CYP3A4 субстратов включают водород-связующий акцепторный атом, который находится на расстоянии 5.5 до 7.8 Å от сайта метаболизма, который в свою очередь находится на 2 до 4 Å от молекулы кислорода в геме. Дальнейшая молекулярная модель CYP3A4 основанна на ее последовательном сравнении со всеми четырьмя бактериальным CYPS, и наводит на мысль, о взаимодействии множественных гидрофобных областей с субстратами прогестероном и эритромицином [Szklarz GD and Halpert JR (1997) Molecular modeling of cytochrome P4503A4. J Comp Aided Mol Des 11: 265-272.]. Дополнительные изучения, проведенные Halpert и др. [Harlow GR and Halpert JR (1997) Alanine-scanning mutagenesis of a putative substrate recognition site in human cytochrome P4503A4. J Biol Chem 272: 5396-5402; Domanski TL, Liu J, Harlow GR and Halpert JR (1998) Analysis of four residues within substrate recognition site 4 of human cytochrome P450 3A4: Role in steroid hydroxylase activity and alpha -napthoflavone stimulation. Arch Biochem Biophys 350: 223-232.] с использованием аланин-сканирующего мутагенеза идентифицировали остатки аминокислоты, необходимые для субстратной специфики и флавоноид активации CYP3A4. [Three-Dimensional-Quantitative Structure Activity Relationship Analysis of Cytochrome P-450 3A4 Substrates., Sean Ekins, Gianpaolo Bravi , James H. Wikel and Steven A. Wrighton]