Реферат: Інтенсивна терапія та хірургічна корекція асептичного та інфікованого панкреонекрозу
В експеримент тварин розподілили на 2 групи. Першу групу склали 9 тварин, у яких вивчали механізм загибелі клітин підшлункової залози ( ПЗ) у рані строки ГЕП (через 2; 5 та 24 години). Другу групу склали 24 тварини з ГЕП (по 8 у кожній сер дослідів). У них вивчали стан клітинної ланки імунної системи Т-лімфоцитів (СD3), Т-хелперів (CD4), CD16, В-лімфоцитів (CD19), цитотоксичних лімфоцитів (CD8), коефіцієнта CD4/CD8, CD45, рецептора для Fas-ліганда (CD95 - індукує апоптоз клітини), після використання синтетичного IL-2 (препарат вводився по 250 тис. п/шк за 10 діб, за 2 доби та відразу після операції у поєднанні з дезінтоксикаційною, антибактеріальною, антисекреторною, антиоксидантною, антицитокіновою, антиангінальною терапією). Контрольна група була представлена 3 тваринами після лапаротомії та 2 інтактними тваринами.
В експеримент проводили біохімічні дослідження: амілази крові за методом Carawey W. T. (1959), активності панкреатичної ліпази за Tietz N. W. et al., (1959). Естеразну активність трипсину визначали за методом В.А.Шатерникова (1978), естеразну активність еластази за методом К.Н.Веремєєнко та співавт (1988). Біохімічн дослідження на моделі ГЕП виконані у 5 середовищах: в гомогенаті, у венозній крові та інтерстиціальній рідині ПЗ, в периферичній крові, у перитонеальному ексудаті. Дослідження ферментів проводили в динаміці експерименту: до моделювання, через 15 хвилин, через 5 годин та через 24 години після операції.
Для гістологічного дослідження забирали шматочки ПЗ, що фіксувались у 10% водному нейтральному розчині формаліну, потім проводили через батарею спиртів і заключали в парафін за загальноприйнятим методом. Парафінові зрізи фарбували гематоксиліном-еозином, метиленовим синім.
Для електронно-мікроскопічного дослідження тканину ПЗ фіксували в 2,5% розчин глутаральдегіду на 0,1М фосфатному буфері і дофіксовували в 1% розчині чотирьохокису осмію на фосфатному буфері, 1% розчин танінової кислоти, зневоднювали в батареї спиртів зростаючої концентрації та ацетоні, проводили в сумішах ацетону та епону і заливали в капсулах чистим епоном. Напівтонкі та ультратонкі зрізи готували на ультрамікротомі УМПТ-4. Напівтонкі зрізи розташовували на предметному склі та фарбували 1% розчином метиленового синього. Ультратонкі зрізи вкладали на мідні опорні сіточки та контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю за Рейнольдсом.
Для з'ясування механізму загибелі панкреоцитів при ГЕП нами використані морфологічні дослідження з аналізом хроматину, зрізи обробляли за методом TUNEL. Це дозволяло диференціювати характер деструктивних процесів у клітині на ранніх етапах патологічного процесу.
Комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова (протокол №6 від 26 березня 2008 р.) встановлено, що проведені дослідження відповідають етичним та морально-правовим вимогам згідно наказу МОЗ України 281 від 01.11.2000 р.
Після закінчення терміну спостереження, тварин виводили з досліду шляхом передозування наркозу з дотриманням основних вимог до евтаназії, викладених у додатку 4 “Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных” затверджених наказом №755 від 12.08 1977 року МОЗ СРСР “О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных”.
Клінічний
розділ
роботи включав результати аналізу комплексного обстеження та лікування 391
хворих на НП, які перебували на лікуванні в клініці хірургії Вінницького
національного медичного університету
м. М.І. Пирогова у період з 2001 по 2007 рік. З них ретроспективно
проаналізовані результати обстеження лікування 108 хворих на НП. Більшу частину
хворих склали чоловіки – 284 (72,63%), жінки – 107 (27,37%). Вік хворих
варіював від 17 до 78 років. У середньому він складав 41,4±3,3.
При використанн клініко-лабораторних та інструментальних технологій інтерстиціальна форма гострого панкреатиту (ГП) встановлена у 144 (36,8%) спостережень, асептичний панкреонекроз виявлений у 170 (43,47%), інфікований – у 59 (15,08%), панкреатогенний абсцес – у 18 (4,6%). Базуючись на критеріях цієї класифікації (Атланта, США, 1992) визначено, що тяжкий НП був у 247 (63,2%). Тяжкий перебіг встановлювали при органній недостатності, виявлених УЗД або КТ некротичних змін у підшлунковій залозі, скупчень рідини у парапанкреатичних ділянках чи у вільній черевній порожнині.
Серед хворих на тяжкий НП, дрібновогнищевий панкреонекроз виявлений у 159 (64,37%). Деструктивний процес захоплював від однієї до двох анатомічних ділянок ПЗ, а об'єм некрозу у них не перевищував 30% від її площі. Тільки у 23 (9,31%) випадках некроз мав розповсюджений характер (табл. 1).
Крупновогнищевий панкреонекроз мав місце у 56 (22,67%) хворих на НП. Об'єм ураження підшлунково залози у них складав від 30% до 50%. Процес деструкції у всіх хворих виходив за межі ПЗ і розповсюджувався на 2 та більше ділянок заочеревинного простору у 36 (59,01%) пацієнтів.
Таблиця 1
Розподіл хворих за характером запалення та розповсюдженості процесу
| Характеристика |
Асептичний НП (n=170) |
Інфікований НП (n=55) |
Прогресуючий НП (n=12) |
| Дрібновогнищевий (n=159) | 143 (84,11%) | 16 (29,09%) | - |
| Крупновогнищевий (n=56) | 27 (15,88%) | 23 (41,18%) | 6 (50%) |
| Субтотальний (n=22) | - | 16 (29,09%) | 6 (50%) |
| Обмежений | 141 (82,94%) | 31 (56,36%) | - |
| Розповсюджений | 29 (17,05%) | 24 (43,63%) | 12 (100%) |
Субтотальний та тотальний панкреонекроз виявлений у 22 (8,90%) з масштабом ураження більше ніж 50% тканини ПЗ. У більшості хворих цієї групи процес розвивався стрімко. У 6 хворих цієї групи була блискавична форма НП. Переважав геморагічний тип панкреонекрозу, що розповсюджу-вався за межі ПЗ на органи заочеревинного простору та черевної порожнини. Об’єм та характер враження органів заочеревинного простору визначав різну тактику хірургічного втручання, вибір дренуючих операцій, тактику повторних втручань.
Хворі на некротичний панкреатит, що знаходилися на лікуванні в клініці протягом 2001–2007 рр., у яких застосовувалася вдосконалена лікувальна тактика, склали основну групу. У дослідження включено 247 з НП хворих (чоловіків – 164, жінок 83 , середній вік хворих склав 44,6 років). У основній групі виділено 2 підгрупи. І група – 170 хворих на асептичний панкреонекроз (чоловіків - 119, жінок - 51, вік - від 21 до 78 , середній вік 44,4); ІІ група – 77 хворих на інфікований панкреонекроз ( чоловіків - 45, жінок - 32, вік - від 17 до 65 , середній вік - 41,8); ІІІ група (контроль) - 108 хворих на некротичний панкреатит, що лікувалися з 1999-2001 ( ретроспективний аналіз). Чоловіків - 73 , жінок - 35, вік від 25 до 65 , середній вік - 42,2 роки . Таким чином, групи були репрезентативні за статевовіковим складом та клініко-морфологічною формою панкреатиту.
З метою дослідження діагностичних та лікувальних патогенетичних особливостей НП з хворих, які знаходилися в клініці протягом 2002–2007 рр., були сформован окремі репрезентативні групи в залежності від мети та завдань дослідження.
Діагностична програма у хворих на ГП, крім загальноклінічних аналізів крові та сечі, включала біохімічні (білірубін та його фракції, АЛТ, АСТ, сечовина, залишковий азот, креатинін, білок та білкові фракції, електроліти), коагулограму, мунологічні,та бактеріологічні дослідження. У динаміці обстеження хворих проводили оцінку важкості стану ГП по шкалі Ranson (1974) і APACHE II (1985). Рівень пептидів середньої молекулярної маси (ПСММ) визначали скринінговим методом, запропонованим Н.І.Габріеляном та співавт. (1981). Дослідження проводились на спектрофотометрі СФ-24 при довжині хвилі 254 нм. Лейкоцитарний ндекс інтоксикації вираховували за Я.Я.Кальф-Каліфом (1941).
Імунний статус вивчали по кількісному визначенню різних популяцій лімфоцитів CD3, CD4, CD8, CD4/CD8, CD16, CD20. Вивчали концентрацію в сироватці крові TNFa, IL–1b, IL–8, IL–1Ra, IL–1Ra/TNFa, концентрацію циркулюючих імунних комплексів (ЦИК), IgA, Ig М, IgG методом проточної лазерної цитофлуорометрії ( PARTEC). Стан функціональної активност гранулоцитів вивчали по спонтанному та стимульованому HCT-тестам в реакц відновлення нітросинього тетразолію.
В окремих сформованих групах хворих визначали показники мікроелементного гомеостазу (малоновий діальдегід (МДА) плазми крові за модифікованим методом Стальної І.Д (1998), каталазу (КТЛ) еритроцитів за методом Королюка М.А. (1986), С-реактивний білок (якісний аналіз). Стан білкового обміну оцінювали за рівнем білкових фракцій сироватки крові.
Визначення концентрації прокальцитоніну (PCT) проводилося з використання реактивів LUMItest® PCT та PCT-Q-тесту (B·R·A·Н·M·S Diagnostica GmbH, Berlin, Germany). Рівні люмінесценції вимірювали на напівавтоматичному хемілюмінесцентному аналізаторі Magic® Lite II фірми Ciba Corning ( Великобританія).
Комплекс бактеріологічних досліджень включав мікробіологічне вивчення вмісту черевно порожнини, пунктату в динаміці та бактеріологічні аналізи на гемокультуру. Якісний склад мікроорганізмів визначали класичною методикою посіву на кров’яний агар з послідуючою інкубацією у термостаті при температурі 37°С протягом 20 годин. При виявленні в добовій культурі мікробних асоціацій проводили ідентифікацію всіх колоній , що виросли з домінуючої флори.
Чутливість мікрофлори до антибіотиків визначали експрес-методом М.Ф.Камаєва і В.П.Ващука (1975). Відповідь отримували через 4 години. Достовірність експрес-методу контролювали стандартним способом (відповідь через 24-48 годин).
Для виконання лапароскопії використовували набір інструментів фірми “Карл Шторц” (Німеччина). Для гастродуоденоскопії, ретроградної холангіографії і ендоскопічно папілотомії – фіброволоконний відеоендоскоп Fujinon EVE W-88A. Ендоскопічне дослідження шлунку, дванадцятипалої кишки виконували за допомогою фіброгастро- та фібродуоденоскопів фірми Olympus GIF-P3 та GIFQ10. Для комп'ютерної томограф (КТ) використовувався апарат ELSCINT select SP (CT 9401) з рентгенівською спіральною трубкою 360 за 1,8 с із товщиною зрізу 1 см, ікретент 7 мм. Для ультразвукового дослідження (УЗД) ми використовували УЗ апарат SHIHADZU SDV 2000, що працює в режимі реального часу та оснащений конвексним, секторним та лінійним датчиками з робочою частотою сканування 3,5-7,5 МГц.
Інтенсивна терапія була стандартизована у відповідності із визначеним лікувально-діагностичним алгоритмом (раціональна антибіотикопрофілактика, корекція кислотно-основного та водно-електролітного обміну, дезінтокси-каційна терапія, інгібітори протеолітичних ферментів, антисекреторна, знеболююча, антиоксидантна, антицитокінова, імуномодулююча терапія, метаболічне забезпечення, екстракорпоральна детоксикація).
Імунокорекцію здійснювали шляхом використання рекобінантного IL-2 "Ронколейкін ®" 0,5 мг (при масі тіла <70 кг) чи 1,0 мг (при масі >70 кг) розчиняли у 200 мл фізіологічного розчину, в який попередньо додавали 10 мл 10% альбуміну. Препарат вводиться внутрішньовенно крапельно повільно (15 крапель на хв.) в 1 добу від початку захворювання з інтервалом 48 год. (від 3 до 9 введень). Доза та кратність введення визначаються типом імунної відповіді: синдромом системно запальної відповіді (ССЗВ) чи імунодепресією. Число інфузій від 3 до 9 через кожні 48 годин до вираженого клінічного ефекту та нормалізації абсолютного числа лімфоцитів та їх субпопуляцій (СD3, CD4, CD8).
Для корекц нтоксикаційного синдрому ізольовано і поєднано використовувалися засоби методи інтра- і екстракорпоральної детоксикації. Як методи інтракорпорально детоксикації застосовувалися: 1) інфузійна терапія (внутрішньовенна) дезінтоксикаційних засобів (сорбілакт, реосорбілакт, рефортан, стабізол), а також метод гемодилюції з наступним форсованим діурезом; 2) інтестинальний діаліз (фізіологічний розчин по 500 мл 2-3 рази на добу); 3) ентеросорбція (50 г ентеросгелю чи 30 г поліфепана на 300 мл фізіологічного розчину 2-3 рази на добу).
З метою екстракорпоральної детоксикації використовували обмінний плазмаферез (ПФ). Його здійснювали з використанням центрифуги РС-6 і полімерних контейнерів Гемакон 500/300”. В середньому цей метод починали проводити через 2,46±1,3 доби після поступлення пацієнта в відділення інтенсивної терапії. Заміщення плазми здійснювали шляхом інфузії поліелектролітних розчинів, розчинів синтетичних амінокислот, реополіглю-кіну, 5-10% розчинів альбуміну. Перед початком сеансу ПФ здійснювали інфузію лікарських препаратів в черевний стовбур за допомогою нфузомату. До складу інфузату включали антиферментні препарати (50-100 тис. ОД за контрикалом) з метою утворення неактивних комплексів з протеазами та цитокінами для подальшого їх виведення під час ексфузії. Для відновлення органного кровообігу ("розкриття вогнища") використовували внутрішньо-артеріальну інфузію реологічно активних засобів (рефортан, реополіглюкін). Одноразово заміщали в середньому 550±65 мл плазми. Сеанси проводили через день, курс лікування - 3-6 сеансів у залежності від ступеня прояву інтоксикації і динаміки клініко-лабораторних показників.
Статистичне опрацювання показників проводили за допомогою стандартних комп'ютерних програм (Statistica 6.0 for Windows).
Основні результати досліджень. Для з'ясування механізмів загибелі панкреацитів при ГЕП ми використали поєднання морфологічного дослідження з аналізом хроматину, що дозволяє диференціювати характер деструктивних процесів в клітині на ранніх етапах патологічного процесу.
Через 2-2,5 години від початку ніціації гострого панкреатиту у всіх піддослідних тварин був виражений міжклітинний набряк ПЗ, міжацинарний простір розширений. Серед ацинусів з нормальною будовою визначалися групи клітин з деструктивними змінами різного типу. Найхарактернішою була ознака втрати еозинофілії та базальної базофіл цитоплазми, ущільнення ядра, розширення перинуклеарного простору, полярність клітини порушення, ядро займало центральне положення. Межі клітини були нечітк та розмиті. Кількість гранул як в набрякових так і в пікнотичних панкреоцитах була різко зменшена. Хроматин сконденсований у вигляді великих брилок біля оболонки ядра та зміщений до його полюсів у вигляді на півмісяця. Ці зміни є раннім проявом апоптозу, що передує процесу деградації. Ця стадія розвитку клітинно загибелі визначалася як преапоптоз.
Визначався розпад ядра на фрагменти – типові апоптозн тільця. Ознаки некрозу визначені лише у 11,11% випадків експериментального ГП: різке набухання ядра, хроматин подібний на пластівці, набряк та вакуолізація цитоплазми, розриви ядерної та плазматичної мембран.
При забарвленні за методом TUNEL на зрізах тканини виявлялися множинні ядра, що дають позитивну реакцію на фрагменти ДНК, при цьому найінтенсивніша реакція характерна для зони щільних ядер. Це один з основних проявів апоптозу на біохімічному рівні, який реалізується в ядрі клітини і складається з фрагментації ДНК. Вже на цій стадії реєструвалася конденсація хроматину та вип’ячування ядерної мембрани, що характерні для апоптозу. Саме цей початковий етап фрагментації хоматину був ключовим моментом апоптозу, після якого процес був незворотнім..
Через 5 години від початку ініціації ГП у більшост тварин визначалися групи слабко забарвлених без'ядерних клітин та їх фрагменти, між якими розкидані окремі кулькоподібні накопичення конденсованого хроматину. В двох тварин визначенні крововиливи та невеличкі фокуси некрозу ацинарних клітин. У всіх піддослідних тварин незалежно від ступеню пошкодження в зонах деструкції ацинусів спостерігалися нейтрофільні лейкоцити, велика кількість ядер, які дають позитивну реакцію на фрагменти ДНК. Визначені нами зміни ядер: конденсація хроматину біля нуклеолеми та зміщення його до полюсів ядер з утворенням півмісяців, деформація та розпад ядра на кульоподібні фрагменти були ознаками апоптозу. Прямим підтвердженням загибелі панкреоцитів шляхом апопотозу у даному експерименті став позитивний тест на міжнуклеосомні розриви ДНК, як виявлені при забарвленні за методом TUNEL.
