Реферат: Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii
Реферат: Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii
Министерство общего и профессионального образования
Российской Федерации
Воронежский Государственный Педагогический Университет
Выпускная квалификационная работа по специальности 011000 «Химия»
«Исследование некоторых физико-химических свойств
протеиназы Penicillium wortmannii.»
Исполнитель:
ст-ка V курса
Естественно-географического факультета
Шишкина Е.Ф.
Научный руководитель:
кандидат технических наук, доцент
Кочергина Н.И.
ВОРОНЕЖ 1999 г.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение. 3
Глава 1. Обзор литературы. 5
1.1 Протеиназы микробного происхождения. 5
1.2 Ферменты, их физико-химические свойства. 9
1.3 Выделение и очистка препаратов протеиназы. 13
1.4 Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение. 17
Глава 2. Материалы и методы исследования. 27
2.1 Определение рН. 27
2.2 Определение протеолитической активности. 27
2.3 Определение коллагеназной активности. 27
2.4 Определение молекулярной массы. 28
2.5 Определение содержания аминного азота. 28
2.6 Электрофоретические исследования. 29
2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов 29
2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ. 30
Глава 3. Получение препаратов протеиназы Penicillium wortmannii 2091
и исследование их физико-химических свойств. 31
3.1 Разработка условий выделения препарата
Penicillium wortmannii BKMF 2091. 31
3.2 Фракционирование протеолитического комплексного
препарата ферментов. 36
3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента. 37
3.4 Определение молекулярной массы. 40
3.5 Исследование процессов кислотной и термической инактивации. 40
3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента. 44
3.7 Субстратная специфичность. 46
3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья: ноги птиц, шквара. 47
Глава 4. Методическая часть. 57
4.1 Межпредметность – современный принцип обучения. 57
4.2 Межпредметные связи на уроках химии. 61
4.3 Методические рекомендации по реализации принципов
межпредметных связей при изучении тем, связанных
с понятием «ферментные препараты». 63
Выводы. 70
Список литературы. 71
ВВЕДЕНИЕ.
Важнейшим свойством ряда белков является их каталитическая активность. Вещества белковой природы, способные каталитически ускорять химические реакции, называют ферментами. Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено.
Биологические катализаторы по ряду признаков резко отличаются от неорганических катализаторов. Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.
Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность – одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм ингибирующего действия сводится к двум типам торможения (необратимое и обратимое). Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным.
Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию, на чем основано их применение в различных областях промышленности. В хлебопекарной промышленности применяют ферментные препараты, относящиеся к роду Aspergillus. В пивоваренной и спиртовой промышленности применяют амилазы – ферменты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. В кожевенном и меховом производстве применяют препараты протеиназ. Ферменты находят большое применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу применяют для лечения заболеваний ЖКТ. Протеолитические ферменты – плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу – для растворения тромбов в кровеносных сосудах. Кроме того, специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика (заболевание может быть тестировано по уровню содержания фермента или соотношения его множественных форм в крови или реже в моче).
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Протеиназы микробного происхождения.
Протеолитические ферменты синтезируются практически всеми живыми существами. В промышленных целях как источник протеиназ используются животные ткани, растения и клетки микроорганизмов. Наиболее перспективным источником протеиназ следует признать микроорганизмы по ряду существенных преимуществ, связанных, прежде всего, с неограниченностью источников, возможностью широко варьировать свойства методами селекции и генной инженерии, подбором условий биосинтеза, широким спектром ферментных комплексов и глубиной воздействия на различные субстраты, а так же простотой и относительной дешевизной технологии.
Продуценты протеолитических ферментов обнаружены среди самых различных групп микроорганизмов: бактерий (Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas), микромицетов (Aspergillus, Rhizopus, Penicillium), актиномицетов (Streptomyces, Actinomyces). На их основе у нас в стране и за рубежом создано крупнотоннажное производство ферментных препаратов протеолитического действия.
Многие широко распространённые микроорганизмы секретируют значительное количество протеолитических биокатализаторов в окружающую среду, что значительно облегчает задачу их выделения и очистки. Возможность управления образованием ферментов за счёт подбора соответствующей питательной среды и условий культивирования позволяет не только увеличить выход протеолитических ферментов, но и получать ферментные препараты с определёнными свойствами. Методы селекции и генной инженерии значительно увеличивают возможности целенаправленного биосинтеза ферментов. Существенна способность микроорганизмов вырабатывать ферменты, уникальные по своей субстратной специфичности (кератиназы, коллагеназы, эластазы).
Большое внимание, уделяемое изучению протеолитических ферментов микроорганизмов, привело к получению значительного числа препаратов бактериальных и грибных протеиназ в высокоочищенном состоянии.
В настоящее время в номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подклассам. По современной классификации протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз и образуют подкласс пептид-гидролаз, или протеаз. Протеазы обычно подразделяются на пептидазы и протеиназы. Однако чёткого разделения по этому признаку нет, так как установлено, что протеиназы (пепсин, трипсин, папаин и другие) гидролизуют пептидные связи не только в белках, но и различных полипептидах. За последние годы значительно изменились представления о протеолитических ферментах. Согласно классификации Бергмана, подкласс пептид-гидролаз делится на две группы: эндопептидазы и экзопептидазы, которые отличаются специфичностью действия на субстрат. Эндопептидазы гидролизуют пептидные связи, отщепляя последовательно концевые аминокислоты. Эндопептидазы могут действовать на центральные участки пептидной связи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты. Экзопептидазы не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи и действуют, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты.
Необходимо отметить, что многие из протеолитических ферментов микробного происхождения получены в кристаллическом виде, например, субтилизин КФ 3.4.21.14, сериновая эндопептидаза Alternaria КФ 3.4.21.16, сериновая протеиназа Arthrobacter КФ 3.4.21.14, кислая протеиназа Aspergillus oryzae КФ 3.4.23.6, кислая протеиназа Penicillium janthinellum КФ 3.4.26.6. и другие. Часто под одним номером находится очень много ферментов, получаемых из различных источников, но имеющих сходные свойства.
В промышленности чаще всего получают комплекс протеолитических ферментов, достоинства которого определяются с учётом аспектов последующего применения ферментного препарата. Общая протеолитическая активность препаратов определяется на стандартных субстратах (казеине, гемоглобине, казеинате натрия) в соответствии с известными методами и используется для сравнения эффективности их действия на специфические субстраты (коллаген, эластин, кератин, желатин и т.д.).
Следует отметить, что у нас в стране проведены определённые исследования и обобщения по эффективности микробных протеиназ при расщеплении белков животных тканей. Однако лишь для немногих из них глубоко изучены физико-химические свойства, проведена идентификация функциональных групп каталитического центра, исследованы кинетика гидролиза субстратов и субстратная специфичность, расшифрована первичная структура.
Производство протеолитических препаратов организовано на основе микроскопических грибов родов Aspergillus и Rhizopus при поверхностном культивировании продуцентов, а также на основе бактерий Bacillus (subtilis, mesentericus, licheniformis, cereus и др.) при глубинном культивировании.
Протеиназы, полученные из этих культур, обладают высокой активностью. Они находят широкое применение в различных отраслях промышленности для гидролиза животных и растительных белков. Среди микроорганизмов – продуцентов протеиназ не менее важное место, чем бактерии, занимают актиномицеты Streptomyces (bradia, griseus, fradiospiralis). Впервые способность синтезировать протеиназы актиномицетами была показана Ваксманом, а затем Красильниковым. С тех пор большое число работ советских и зарубежных учёных посвящено изучению протеолитических ферментов актиномицетов [6, 17]. В настоящее время появились работы, где описано использование актиномицетов в качестве продуцентов кератиназы [24], эластазы [28], коллагеназы [26]. Однако промышленный выпуск протеиназ из актиномицетов развит слабо. Известны лишь препараты протеиназ Streptomyces griseus и Streptomyces fradie.
Однако проведение глубоких исследований ферментов у микроорганизмов осложняется высокой гетерогенностью синтезируемых протеолитических комплексов, требующих особо тонких и чувствительных методов выделения и очистки. Комплексные препараты, получаемые на практике, дают специфические эффекты при гидролизе субстратов. Так, например, протеолитические ферменты бактериального и грибного происхождения действуют в основном на белки мышечной ткани. Вместе с тем, известны комплексные препараты, проявляющие активность в отношении коллагена и эластина. При исследовании различных субтилизинов установлена их высокая каталитическая активность и невысокая специфичность гидролитического действия, что допускает их использование в различных пищевых технологиях.
Протеиназа из Actinomyces fradiae,отнесённая к типу трипсиноподобных, способна также гидролизовать казеин, денатурированный коллаген, но не активна в отношении эластина.
Из культуральной жидкости Bacillus mesentericum 316М выделяют комплексный ферментный препарат, обладающий высокой протеолитической активностью к фибриллярным белкам, в том числе коллагену и эластину.
Из отходов производства антибиотиков получен протеолитический препарат (источник Streptomyces griseus). Он обладает высокой казеинолитической активностью, подвергая при этом гидролизу гемоглобин, эластин, коллаген и желатин.
Получение высокоочищенных фракций ферментов – длительный, сложный и дорогой процесс, а применение комплексных препаратов не всегда даёт желаемый эффект и требует исследования условий гидролиза не только на чистых субстратах, но и при обработке сложных белковых систем. При этом интерес представляет как глубина протеолиза, так и качественная характеристика продуктов реакции, поскольку именно они определяют не только функциональные, биологические и технологические свойства продуктов, но и могут проявлять физиологические эффекты в составе пищи.
1.2 Ферменты, их физико-химические свойства.
Протеиназы, включающие ферменты микробного происхождения, составляют около половины производства препаратов на мировом рынке. Их эффективность и мощность намного превосходят синтетические катализаторы. Они высокоспецифичны по отношению к своим субстратам и ускоряют строго определённые химические реакции без образования побочных продуктов; ферменты функционируют в разбавленных водных растворах при физиологических значениях рН и температуры.
Ферменты – функциональные единицы клеточного метаболизма. Действуя в строго определённой последовательности, они катализируют сотни многостадийных реакций, в ходе которых расщепляются молекулы питательных веществ, запасается и преобразуется химическая энергия, и из простых молекул-предшественников строятся макромолекулы, входящие в состав клетки.
Ферментативный катализ происходит на расстоянии длины химической связи, поэтому акт катализа совершается на определённом участке поверхности макромолекулы, называемом активным центром. Современный уровень экспериментальных исследований позволил доказать, что он представляет собой набор небольшого числа функциональных групп, расположенных близко друг от друга и имеет вид впадин, выемок на поверхности молекулы фермента. Функциональные группы активного центра могут принадлежать звеньям полипептидной цепи, весьма удалённым друг от друга. Сближение их связано с формированием третичной структуры молекулы фермента.
