Учебное пособие: Практикум по энзимологии

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5∙10-5 М)***.

* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.

** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na2SO3 приливают 11,3 мл 1 н HCl и 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН2РО4 растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.

**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

 Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.

опыт	контроль 1	контроль 2
100 мкл фракции	100 мкл фракции	100 мкл буфера
Инкубация 10 мин при 37°С	–	–
100 мкл Г-6-Ф	100 мкл буфера	100 мкл Г-6-Ф
Инкубация 20 мин при 37°С
2 мл 10 % ТХУ

Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.

опыт	контроль 1	контроль 2	стандарт
1 мл надосадочной жидкости			1 мл станд. р-ра фосфора
5 мл раствора молибдата

Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.

Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.

Содержание отчета

1. Обоснуйте наличие в данной методике двух контролей и стандарта.

2. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы:

Фракции

Г

Я

ТМ

ЛМ

Р

С

Анализируемые пробы

Оп. Кн.

Оп. Кн.

Оп. Кн.

Оп. Кн.

Оп. Кн.

Оп. Кн.

Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее

Аоп – Акн

Количество фосфата

Активность на 1 мг ткани

Активность фракции в % от гомогената

100%

Количество белка на 1 мг ткани

Белок в % от белка гомогената

100%

Относительная удельная активность фракций

Работа 15. Определение глюкозы в крови человека с использованием ферментных электродов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматический анализатор Roche Omni S 6**.

*Для работы используется капиллярную кровь из пальца. Палец обработать ватой, смоченной медицинским спиртом, произвести прокол скарификатором с помощью автоматической ручки-прокалывателя. Кровь собирать в стеклянный капилляр Roche.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

В ферментных электродах фермент и электрод образуют единую конструкцию, не требующую для функционирования дополнительных реагентов, кроме буферных растворов. Такие электроды получили название «безреагентных» датчиков, а основанные на их использовании методы анализа называются «безреагентными». Для определения глюкозы используется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованная ковалентным связыванием с полупроницаемой поликарбонатной мембраной. Измерение осуществляется с помощью амперометрии. Операционные характеристики электрода остаются стабильными на протяжении двух-четырех недель.

Проведите измерение трех разных образцов крови. Переведите прибор в режим работы с капиллярной кровью. Снимите верхнюю крышку с анализатора для ознакомления с ходом распределения образца крови во время анализа. Поместите капилляр с образцом в диск-приемник (Fill Port). Активируйте всасывание образца. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Изучите распределение образца крови и прохождение буферных и промывающих растворов. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений глюкозы в крови.

2. Зарисуйте схемы устройства ферментного электрода и автоматического анализатора.

Работа 16. Определение мочевины в крови человека с использованием ферментных реагентов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматическая пипетка с наконечниками, биохимический анализатор Рефлотрон +.

*Забор крови осуществляется в капилляр, как описано в работе № 14.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

Биохимический анализатор Рефлотрон предназначен для экспресс-анализа образцов свежей крови и сыворотки человека. Прибор не требует для работы никаких реактивов, кроме тест-полосок для однократного определения исследуемых веществ. Тест-полоска для определения мочевины содержит лиофилизированный фермент уреазу и индикатор в лейко-форме. Образец нагревают, и мочевина, содержащаяся в образце, при 37۫°С расщепляется с образованием аммиака и оксида углерода. Это ведет к частичной смене окраски индикатором на зелено-голубую, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству мочевины в пробе:

(NH2)2CO + H2O = 2 NH3 + CO2

NH3 + индикатор (бесцветный) = NH4+ + индикатор (сине-зеленый).

После 3 минут, необходимых для инкубации образца, измеряется оптическая плотность по принципу рефлексионной фотометрии. На тест-полоске имеется магнитная лента с информацией об анализе. Прибор считывает информацию об анализе и пересчитывает оптическую плотность в концентрацию.

Приготовьте тест-полоску для анализа. Удалите с ее поверхности защитную алюминиевую полоску. Дозатором отмерьте 32 мкл образца и нанесите его в центр зоны аппликации, не касаясь наконечником тест-полоски. Откройте крышку прибора и поместите тест-полоску в анализируемую зону. Закройте крышку. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений мочевины в крови.

Работа 17. Иммуноферментное определение тестостерона в сыворотке крови

Оборудование и реактивы: сыворотка крови человека, автоматическая пипетка с наконечниками, набор стандартных растворов тестостерона с известными концентрациями, иммуноферментный коньюгат, субстратный раствор, стоп-раствор, стрипы с иммобилизованными моноклональными антителами к тестостерону, инкубатор для планшет, вошер для планшет, иммуноферментный ридер планшет.

Тест-система ИФА для определения тестостерона основана на принципе конкурентного связывания. Лунки микротитра покрыты антителом к уникальному антигенному сайту на молекуле тестостерона. Эндогенный тестостерон в пробе конкурирует с конъюгатом тестостерона и пероксидазы хрена за связывание с антителом, которое сорбировано на микропанелях. После инкубации несвязавшийся конъюгат смывается. Количество связавшегося конъюгата обратно пропорционально концентрации тестостерона в образце. При добавлении субстратного раствора интенсивность полученного окрашивания обратно пропорциональна концентрации тестостерона в сыворотке.

Общие замечания к проведению анализа

− Все пробы и реагенты перед проведением анализа должны быть доведены до комнатной температуры. Смешивание реагентов надо осуществлять, избегая вспенивания.

− После начала проведения теста следует осуществлять все этапы последовательно без прерывания.

− Для каждого реагента используйте новые чистые пластиковые наконечники микропипеток для исключения перекрестной контаминации. Для раскапывания субстрата и останавливающего раствора не следует использовать пипетки с металлическими частями.

− Вносите стандарты и пробы в нижнюю часть лунки с помощью микропипетки. Что касается внесения Иммуноферментного Конъюгата и Стоп-раствора, рекомендуется держать пипетку вертикально и направлять падающую каплю строго в центр лунки для осуществления полного перемешивания указанных компонентов.

− Перед постановкой теста рекомендуется подготовить все реагенты, снять крышки, закрепить в держателе необходимое количество полосок с лунками. Это обеспечит равные затраты времени на все необходимые этапы ИФА и предотвратит задержки пипетирования.

− В целом ферментативная реакция обычно линейно пропорциональна времени проведения и температуре. Это делает возможной интерполяцию для физико-химических условий реакции. В частности, если величина абсорбции нулевого стандарта ниже 1,0 или же превышает верхний уровень возможного измерения для используемого ридера, можно изменить время инкубации с субстратом до 30 мин, или же до 10 мин, соответственно этим наблюдениям.

− Поскольку калибрующие стандарты проставляются в каждом тесте, флюктуации абсолютных величин абсорбции не отражаются на конечном результате ИФА.

− Раствор субстрата перед использованием должен быть бесцветным или иметь чуть различимый голубовато-зеленоватый оттенок. Наличие выраженного голубого окрашивания указывает на непригодность субстрата. Его следует заменить!

− Во время инкубации с Субстратом следует защитить микротитровальные панели от света.

ЗАБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ АНАЛИЗА

1. Для исследования надо использовать сыворотки, или же плазму после обработки EDTA. Не требуется какой-либо дополнительной подготовки проб. Пробы для анализа можно хранить при 2 – 8 °С до 5 дней, при необходимости более длительного хранения пробы необходимо замораживать и хранить при – 20 °С или более низкой температуре. Не используйте пробы с выраженным гемолизом или с повышенным содержанием липидов.

2. Пробы, содержание тестостерона в которых предположительно превышает 16 нг/мл, следует разводить с использованием нулевого стандарта.

3. Если при первой постановке образец сыворотки показал концентрацию больше, чем высший стандарт, то образец должен быть разведен в 10 или в 100 раз нулевым стандартом и проанализирован снова. При подсчете должен приниматься во внимание фактор пересчета.

ВНИМАНИЕ! В данном тесте нельзя использовать пробы, содержащие азид натрия.

1. Закрепите желаемое количество полосок с подготовленными лунками в держателе.

2. Внесите по 25 мкл стандартов тестостерона и проб в соответствующие лунки.

3. Внесите 200 мкл иммуноферментного конъюгата в каждую лунку.

4. В течение 10 сек. смешивайте реагенты в панели. На этом этапе чрезвычайно важно добиться полного смешивания реагентов.

5. Не закрывая панель, инкубируйте при комнатной температуре 60 мин.

6. Освободите лунки от содержимого (например выплеснув и постучав по фильтровальной бумаге). Трижды промойте лунки раствором для промывки (по 400 мкл в лунку). Тщательно выбейте” остатки жидкости на фильтровальной бумаге. Операцию № 6 рекомендуется осуществлять в автоматическом режиме, используя автоматический вошер для планшет.

7. Внесите 200 мкл энзим-субстрата в каждую лунку с равными временными интервалами.

8. Инкубация 15 мин при комнатной температуре.

9. Остановите реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп-раствора с такими же временными интервалами, как на этапе 7.

10. Измерьте оптическую плотность в лунках при длине волны 450 + 10 нм в течение 10 мин после добавления стоп-раствора

Содержание отчета

1. Определите значение абсорбции для стандартов и образцов.

Конц. стандартов, нг/мл
Величина абс., D

2. Используя любую миллиметровую или логарифмическую сетчатую бумагу, постройте стандартную кривую, нанося значения абсорбции (Y) Стандартов против их концентрации (Х) в нг/мл.

3. Используйте среднюю величину абсорбции каждой пробы для интерполяции концентрации Тестостерона путем простого наложения данных на указанную кривую.

Запишите концентрацию тестостерона в сыворотке крови.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Работы № 11 – № 14 выполняются каждая в течении одного дня, так как ферменты-маркеры субклеточных фракций инактивируются при замораживании-оттаивании. В случае нехватки времени на выполнение полной схемы работы выполняются в следующем варианте:

- активность ферментов-маркеров определяется в свежеприготовленном 1% гомогенате. 100 мг печени гомогенизируется в 1,9 мл рабочего буфера (в работе № 11 - 0,01 М трис-буфер рН 7,4; в работе № 12 - 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; в работе № 13 - буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; в работе № 14 - 0,1 М цитратный буфер рН 6,5). Затем гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок.

2. Определение белка по Лоури. Необходимые реактивы: реактив Фолина, реактив А, реактив В.

Реактив А. 0,5 г CuSO4·5H2O + 1 г цитрата Na на 100 мл воды, хранить в морозильнике. Для использования разморозить небольшую часть и хранить в холодильнике.

Реактив В. 4 г NaOH + 54 г Na2CO3·10H2O (или 20 г Na2CO3) на литр воды.

Реактив С. 50 мл В + 1 мл А. Готовить непосредственно перед определением концентрации белка.

Для определения концентрации в три пробирки наливают по 0,5 мл разведенного раствора белка, в каждую из трех пробирок и в контроль (0,5 мл дист. воды) приливают по 1 мл реактива С, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Затем приливают по 0,1 мл реактива Фолина и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Можно больше. Все пипетки сразу промыть дистиллированной водой. Измеряют светопоглощение на ФЭК при λ=750 нм в кювете толщиной 1 см против контроля.

Библиографический список

1. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. - М.: Наука, 1986. – 332 с.

2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - Т. 1 – 3.

3. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир,

1980. – 432 с.

4. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.

5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высш. школа, 1980. – 272 с.

6. Практикум по биохимии/ под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьёвой.

– М.: МГУ, 1989. – 509 с.

7. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. – М.: Наука, 1978. – 248 с.

8. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир,

1979. – 280 с.

9. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. – М.: Мир, 1983. – 293 с.

10. Бернхард С. Структура и функция ферментов. – М.: Мир, 1971. – 334 с.

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. Г. БЕЛИНСКОГО

В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин

Практикум по энзимологии

Учебно-методическое пособие

Редактор Л. И. Дорошина

Корректор Е. С. Моисеева

Оригинал-макет В. Б. Соловьев

Поз. 157

Подписано к печати 07.12.07 Формат 60 × 84 / 16

Бумага писчая белая Печать офсетная

Усл. печ. л. 3,0 Уч. – изд. л. 3,2

Тираж экз. 100 Заказ № 175 / 07 Цена С. 183

Редакционно-издательский отдел ПГПУ им. В. Г. Белинского:

440026, Пенза, ул. Лермонтова, 37,

Педагогический университет, корпус 5, комната 466

Отпечатано с готового оригинал-макета в мини-типографии

ООО КФ «Партнер-ДелКон»:

г. Пенза, ул. Богданова, 2а,

тел. 52-58-60, 52-58-61

E-mail: p-audit@p-audit.ru, www.p-audit.ru