Учебное пособие: Практикум по энзимологии

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,32 М сахарозы, рН 7,55; 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; 8% раствор гемоглобина; 5% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); тирозин кристаллический; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б).

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

Активность кислых протеаз определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.

Пробы центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и определяют количество образовавшегося тирозина спектрофотометрически при 280 нм. Количество белка в супернатанте определяют спектрофотометрически при 280 нм. Активность фермента определяют по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

Готовят рабочий раствор тирозина с концентрацией 100 мкг/мл. Затем производят его разведение в соответствии со схемой.

Содержание отчета

1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.

Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.

* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

 Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:

а) кинетическая схема определения активности.

Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l = 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.

Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.

б) стационарная схема определения активности.

Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.

Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.

Содержание отчета

1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.

Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5