Статья: Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов
Во всех экспериментах по включению стабильных изотопов в молекулы аминокислот уровни включения 2Н и 13С в метаболически связанные аминокислоты обнаружили определённую коррелляцию. Так, уровни изотопного включения для валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот) коррелируют (см. табл. 2). Уровни изотопного включения для глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и в лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Из данных табл. 2 видно, что уровни изотопного включения секретируемых аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка при выращивании бактерий на средах с одинаковым изотопным насыщением, в целом, также коррелируют. Причина некоторых наблюдаемых расхождений в уровнях включения изотопов в молекулы аминокислот до конца не изучена.
Данный биосинтетический подход показал хорошие результаты по изучению введения дейтериевой метки в молекулу бактериородопсина, выращенного на среде, содержащей L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин, L-[3,5-2Н]тирозин и L-[2,4,5,6,7-2Н]триптофан (рис. 8). Как видно из рис. 8, в масс-спектре дериватизованного гидролизата бактериородопсина детектируются пики, соответствующие молекулярным ионам обогащённых дейтерием метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина с молекулярным ионом при m/z 417 (ср. m/z 412 для немеченого производного фенилаланина), N-Dns-тирозина с М+. при m/z 429 (ср. m/z 428 для производного тирозина) и N-Dns-триптофана с М+. при m/z 456 (ср. m/z 451 для производного триптофана). Все они отвечают смеси изотнопозамещённых форм аминокислот, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Множественный характер включения дейтерия свидетельствует о возможном вкладе биосинтеза de novo в уровни дейтерированности ароматических аминокислот, но также не исключено, что он определяется самим способом получения изотопномеченых молекул. Кроме вышеобозначенных аминокислот в масс-спектре фиксируются пики молекулярных ионов метиловых эфиров -N-Dns-глицина (m/z 322), N-Dns-аланина (m/z 336), N-Dns-валина (m/z 364) и N-Dns-лейцина/изолейцина (m/z 378). Как и следовало ожидать, эти аминокислотные остатки в бактериородопсине не содержат дейтерия.
Таким образом, проведённые исследования продемонстрировали эффективность масс-спектрометрии электронного удара N-Cbz-производных аминокислот и метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот для исследования уровней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их мультикомпонентных смесей, полученных биосинтетически с использованием микроорганизмов. Метод незаменим для изучения состава пула аминокислот, секретируемых в культуральные жидкости штаммов-продуцентов, выращенных на средах со стабильными изотопами.
Экспериментальная часть
В работе использовали D, L-аминокислоты (Reanal, Венгрия), аденозин- и уридин-5-монофосфаты (Sigma, США), панкреотическую телячью дезоксирибонуклеазу I (Fluka Chemie AG, Швейцария), додецилсульфат натрия (Chemapol, Чехо-Словакия). L-[2,3,4,5,6-2Н5]фенилаланин (90 ат.% 2Н), L-[3,5-2Н2]тирозин (96 ат.% 2Н) и L-[2,4,5,6,7-2Н5]триптофан (98 ат.% 2Н) (способы получения указаны в работах [34, 35]), были предоставлены А. Б. Пшеничниковой (МИТХТ им. М. В. Ломоносова). Для синтеза производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, США), бензилоксикарбонилхлорид (Войковский химзавод, РФ) и диазометан, получаемый из N-нитрозометилмочевины (Merck, Германия).
Исследования проводили с генетически маркированными штаммами бактерий, полученными из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:
Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, L-лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина;
Methylobacillus flagellatum KT, L-изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина;
Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин;
Выращивание метилотрофных бактерий B. methylicum и M. flagellatum осуществляли на минеральной среде М9 [36] в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл с наполнением средой 50 мл по методике [23], используя в качестве источников стабильных изотопов (2H)метанол, (13С)метанол и 2Н2O в присутствии L-лейцина для B. methylicum и L-изолейцина для M. flagellatum в концентрациях 10 мг/л. Клетки отделяли центрифугированием (10000 g, 20 мин). В культуральной жидкости анализировали секретируемые аминокислоты.
Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10000 g, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 40 кГц (3 x 15 мин) и центрифугировали. Полученный осадок (10 мг) после отделения липидов и пигментов смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) использовали в качестве фракции суммарных белков биомассы.
Для получения дейтериймеченого бактериородопсина использовали синтетическую среду, содержащую 18 аминокислот, в которой немеченые L-аминокислоты фенилаланин, тирозин и триптофан были заменены их дейтерированными аналогами - [2,3,4,5,6-2Н]фенилаланином, [3,5-2Н]тирозином, и [2,4,5,6,7-2Н]триптофаном (количества компонентов приведены в г/л): (D, L-аланин 0.43, L-аргинин 0.4, D, L-аспарагиновая кислота 0.45; L-цистеин 0.05; L-глутаминовая кислота 1.3; L-глицин 0.06; D, L-гистидин 0.3; D, L-изолейцин 0.44; L-лейцин 0.8; L-лизин 0.85; D, L-метионин 0.37; D, L-фенилаланин 0.26; L-пролин 0.05; D, L-серин 0.61; D, L-треонин 0.5; L-тирозин 0.2; D, L-триптофан 0.5, D; L-валин 1.0); нуклеотиды (аденозин-5-монофосфат 0.1; уридин-5 монофосфат 0.1); соли (NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KСl 2; NH4Cl 0.5; KNO3 0.1; KH2PO4 0.05; K2HPO4 0.05; цитрат натрия 0.5; MnSO4 x H2O 3 x 10-4; CaCl2 x 6H2O 0.065; ZnSO4 x 7H2O 4 x10-5; FeSO4 x 7H2O 5 x 10-4; CuSO4 x 5H2O 5 x 10-5); глицерин 1.0; ростовые факторы (биотин 0.1 x 10-3; фолиевая кислота 10 x10-3; витамин В12 0.02 x 10-3).
Для выделения фракции пурпурных мембран клетки, полученные после отделения культуральной жидкости и двухкратной промывки дистиллированной водой (100-150 мг), суспендировали в 100 мл 0.1 М буфера трис-HCl (рН 7.6), добавляли 1 мг дезоксирибонуклеазы I и инкубировали в течении 5-6 ч при 37 0С, затем разбавляли дистиллированной водой до 200 мл и инкубировали 15 ч при 4 0С. Осадок промывали дистиллированной водой с последующим отделением водной фракции до получения бесцветных промывных вод. Чистоту полученной суспензии пурпурных мембран (в Н2О) контролировали на спектрофотометре Beckman DU-6 (США) по соотношению полос поглощения 280/568 нм (e280 1.1 x 105 М-1см-1 [37] и e568 6.3 x 104 М-1 см-1 [38]).
Бактериородопсин выделяли по методу [39], солюбилизируя препараты пурпурных мембран (50 мг) в 2 мл 0.5% раствора SDS в Н2О и осаждая продукт 5-кратным избытком метанола на холоду (00 С). Выход бактериородопсина составил 17-20 мг.
Электрофорез препаратов бактериородопсина проводили в 12.5% ПААГ с 0.1 % SDS. Образцы для электрофореза готовили стандартным способом (протокол фирмы LKB, Швеция). Для количественного определения содержания синтезированного в клетке белка проводили сканирование прокрашенного в растворе Кумасси-голубой R-250 электрофоретического геля на лазерном денситометре CDS-200 (Beckman, США).
Липиды и пигменты экстрагировали смесью хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) по методу Блайя и Дайера [40].
Гидролиз белка проводили 6 М 2НСl (3% фенола в 2Н2О) или 2 М Ва(ОН)2 (1100С, 24 ч) [41].
N-Dns-аминокислоты. К 4-5 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости и белковых гидролизатов в 1 мл 2 М NaHCO3 рН 9-10 порциями при перемешивании добавляли 25.6 мг дансилхлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при 400 С, затем подкисляли 2 М HСl до рН 3.0 и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот. Для получения диазометана к 20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После окончания интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли, промывали ледяной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки препаратов N-дансиламинокислот в составе культуральной жидкости или гидролизатов суммарных белков биомассы.
N-Cbz-аминокислоты. К 1.5 мл охлажденного до 00С раствора культуральной жидкости (50 мг) или белковых гидролизатов (4-5 мг) в 4 М NaOH добавляли порциями при перемешивании 2 мл 4 М NaOH и 28.5 мг бензилоксикарбонилхлорида. Реакционную смесь выдерживали при 00С, перемешивали 3 ч, подкисляли 2 М HCl до рН 3 и продукты экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
ТСХ производных аминокислот осуществляли на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) в системах растворителей: хлороформ-метанол-уксусная кислота, 10:1:0,3 (А) для N-Cbz-аминокислот и хлороформ-метанол-ацетон, 7:1:1 (Б) для метиловых эфиров N-Dns-аминокислот.
N-Cbz-аминокислоты детектировали по поглощению при 254 нм. Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот детектировали по флуоресценции в УФ-свете.
Аналитическое и препаративное разделение смеси N-Cbz-аминокислот культуральной жидкости и белковых гидролизатов осуществляли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ [31].
Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот разделяли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Knauer, УФ-детектором 2563 и интегратором С-R 3A (Shimadzu, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C18; 18.7 мкм; 150 x 3.3 мм (Kova, Чехо-Словакия); система растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота, (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 0 до 20% В 5 мин, 20 до 100% В 30 мин, 100% В 5 мин, от 100 до 0% В 2 мин, 0% В 10 мин.
Ионнообменную хроматографию белковых гидролизатов осуществляли на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230 x 3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи натрий-цитратного буфера 18,5; нингидрина - 9,25 мл/ч; детекция при 570 и 440 нм (для пролина).
Секретируемый L-фенилаланин и L-лейцин определяли на приборе Beckman DU- 6 (США) при 540 нм, в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после её обработки нингидрином.
Масс-спектры электронного удара производных аминокислот снимали на приборе MB-80 A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Beaufrere B., Fournier V., Salle B., Putet G. // American Journal of Physiology. 1992. V. 263. ¹. 1. P. 214-220.
2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 1-38.
3. Young V. R., Tu Y. M., Krempf M. //New techniques in nutritional research/ Ed. Whitehead R. G. New York. Academic Press. 1990. V. 9. P. 17-72.
4. Fesic S. W. & Zuiderweg E. R. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. ¹ 2. P. 97-131.
5. Haris P. I., Robillard G. T., Vandijk A. A., Chapman D. // Biochemistry. 1992. V. 31. ¹ 27. P. 6279-6284.
6. Rothschild K. J., Braiman M. S., Yi-Wu He., Marti T. and Khorana H. G. // J. of Biological Chemistry. 1990. V. 121. P. 16985-16990.
7. Raap J., Winkel C., de Wit A. H. M., van Houten A. H. H., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Anal. Biochem. 1990. V. 191. P. 9-18.
8. Stockman B. J., Reily M. D., Westler W. M., Ulrich E. L., Markley J. L. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 230-236.
9. Ellman J. A., Volkman B. F., Mendel D. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 7959-7961.
10. Redfield C. , Dobson C. M. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 122-136.
11. Zuiderweg E. R. P., McIntosh L. P., Dahlquist F. W., Fesik S. W. // J. Magn. Reson. 1986. V. 2. P. 210-216.
12. Hruby V. J. // J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. 1985. V. 4. P. 287-292.
13. Berger A., Smolarsky M., Kurn N., Bosshard H. R. // J. Org Chem. 1973. V. 38. P. 457-460.
14. Raap J., Wolthuis W. N. E., Hehenkamp J. J. J., Lugtenburg J. // Amino Acids. 1995. V. 8. P. 171-186.
15. Lugwig S. N., Unkefer C. J. // J. Labelled Compd. Radiopharm. 1992. V. 31. P. 95-102.
16. van der Berg E. M. M., van Liemt J. H., Willem B. S. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. ¹ 9. P. 304-313.
17. McIntosh L. P., Griffey R. H., Muchmore D. C., Nielson C. P., Redfield A. G., Dahlquist F. W. // Proc. Natn. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 1244-1248.
18. Karnaukhova E. N., Reshetova O. S., Semenov S. Y., Skladnev D. A., Tsygankov D. Y. // Amino Acids. 1994. V. 6. ¹ 2. P. 165-176.
19. Katz J. J., Crespi H. L. // Pure Appl. Chem. 1972. V. 32. P. 221-250.
20. Patel G. B., Sprott G. D., Ekiel I. // Applied and Environmental Microbiology. 1993. P. 1099-1103.
21. LeMaster D. M., Cronan J. E. // Journal of Biological Chemistry. 1982. V. 257. ¹ 3. P. 1224-1230.
22. LeMaster D. M. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 133-174.
23. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. 1993. N. 9. С. 16-20.
24. Егорова Т. А., Мосин О. В., Ерёмин С. В., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. // Биотехнология. 1993. N. 8. С. 45-50.
25. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. 1996. ¹ 3. С. 3-12.
26. Stoeckenius W., Bogomolni R. A. // Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 587-616.
27. Первушин К. В., Арсеньев А. С. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. ¹ 2. С. 83-111.
28. Steel J. C. H., Reynolds J. A. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1633-1638
29. Звонкова Е. Н., Зотчик Н. В., Филлипович Е. И., Митрофанова Т. К., Мягкова Г. И., Серебренникова Г. А. // Химия биологически активных природных соединений. М.: Химия, 1970. С.65-68.
30. Cohen J. S., Putter I. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 222. P. 515-520.
31. Egorova T. A., Eremin S. V., Mitsner B. I., Zvonkova E. N., Shvets V. I. // Journal of Chromatography B. 1995. V. 665. P. 53-62.
32. Daniely B. // J. Org. mass spectrometry. 1989. V. 24. P. 225-229.
33. Физер Л. Ф., Физер М. // Реагенты для органического синтеза. М.: Мир, 1971. Т. 2. С. 92.
34. Griffiths D. V., Feeney J., Roberts G. C., Burgen A. S. // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. V. 446. P. 479-585.
35. Matthews H. R., Kathleen S., Matthews K. and Stanley J. // Biochim. et Biophys. Acta. 1977. V. 497. P. 1-13.
36. Miller J. H. // Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1976. P. 393.
37. Oesterhelt D., Hess B. // Eur. J. Biochem. 1973. V.37. ¹.1. P. 316-326.
38. Tokunada F., Ebrey T. // Biochemistry. 1978. V.17. ¹.10. P. 1915-1922..
39. Oesterhelt D., Stoeckenius W. // Methods Enzymol. 1974. V. 31. P. 660-668.
40. Bligh E. G., Dyer W. J. // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. ¹. 8. P. 911-918.
41. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. 1996. ¹ 4. С. 27-32.
MASS-SPECTROMETRY EVALUATION OF 2H AND 13C ENRICHMENT LEVELS OF AMINO ACIDS, OBTAINED FROM BACTERIAL OBJECTS
O.V.MOSIN
M. V. Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moscow, 117571
The high-sensitive method of electron impact mass-spectroscopy was employed for evaluation of 2H and 13C enrichment levels of secreted amino acids of methylotrophic bacteria Brevibacterium methylicum and Methylobacillus flagellatum, and amino acid resigues of total protein obtained from media contaning as a sourse of stable isotopes (2H)methanol, (13C)methanol and 2H2O. The incorporation of L-[2,3,4,5,6-2Н]phenylalanine, L-[3,5-2Н]tyrosine and L-[2,4,5,6,7-2Н]tryptopan in bacteriorhodopsin synthesised in membrane of halophilic bacterium Halobacterium halobium ET 1001 was also made. For mass-spectrometric analysis the multicomponential mixures of amino acids, derived from cultural media and protein hydrolysates after hydrolysis in 6 M 2HСl (3% phenol) and 2 M Ва(OH)2 were modified to N-benzyloxycarbonyl-derivatives of amino acids as well in methyl esters of N-dansyl-derivatives of amino acids which were preparative separated using a method of reverse-phase high column liquid chromatography (HCLP). [2H]- and [13C]amino acids obtained represented the mixures differing in quantities of isotopes incorporated into molecule. The levels of 2H and 13С enrichment of secreted amino acids and amino acid resigues of protein were found to vary from 10% to L-leucine/isoleucine up to 97.5% for L-alanine depending on concentration of labelled substrates.
