Статья: Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов

            В этих условиях для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными образовывались ди-Dns и ди-Cbz-производные. Кроме этого, из аргинина синтезировался N-три-Dns-(Cbz)-аргинин. Поэтому в масс-спектрометрических исследованиях молекулярные ионы М+. этих соединений соответствовали ди- или три- производным.

            Эффективность использования N-Cbz-производных аминокислот в обращённо-фазовой ВЭЖХ и в масс-спектрометрических исследованиях была показана ранее [31, 32]. Летучесть N-производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе может быть повышена за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе, поэтому N-Dns-аминокислоты были переведены в их метиловые эфиры. Для предотвращения обратного изотопного обмена ароматических протонов (дейтеронов) при этерификации дейтериймеченых аминокислот, в данной работе отдали предпочтение использованию диазометана для этих целей [33]. Свежеприготовленным раствором диазометана в диэтиловом эфире обрабатывали сухие остатки смесей аминокислот. При дериватизации аминокислот диазометаном происходило дополнительное N-метилирование по a-NH-(Dns)-группе аминокислот, что приводило к появлению в масс-спектрах метиловых эфиров N-Dns-аминокислот дополнительных пиков, соответствующих соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных.

            В данной работе включение изотопов 2Н и 13С в молекулы аминокислот мультикомпонентных смесей в составе культуральных жидкостей и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара. Метиловые эфиры N-Dns-производных аминокислот или N-Cbz-производные аминокислот препаративного разделяли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ. Степени хроматографической чистоты 2Н- и 13С-содержащих аминокислот, выделенных из культуральных жидкостей B. methylicum и M. flagellatum и гидролизатов белков в виде их N-Cbz-производных аминокислот составили 96-98%, при выходах - 67-89%. Для отдельных аминокислот оказалось более удобным разделение в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот. При этом степень хроматографической чистоты полученных из гидролизатов бактериородопсина метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина, N-Dns-тирозина и N-Dns-триптофана составили 96, 97 и 98% соответственно. Данный результат важен потому, что именно метиловые эфиры N-Dns-аминокислот вследствие своей химической стабильности, наличия высокоинтенсивных молекулярных ионов М+. при высоких молекулярных массах оказались весьма удобными для масс-спектрометрических исследований и позволяют идентифицировать аминокислоты в присутствии низкомолекулярных метаболитов среды и других продуктов дериватизации. Последний факт очень важен для изучения состава пула аминокислот, секретируемых в культуральные жидкости штаммов-продуцентов.            

            Пути фрагментации метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина и N-Dns-лейцина при масс-спектрометрии электронного удара приводят к формированию пиков их молекулярных ионов при m/z 412 и m/z 378 и к образованию дансильных фрагментов и продуктов их дальнейшего распада до N-диметиламинонафталина, а также к получению аминных А+ и аминоацильных фрагментов В+ (рис. 1). Показанная на рис. 1 фрагментация метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина и N-Dns-лейцина характерна для этих производных всех других аминокислот, что позволяет проводить масс-спектрометрический мониторинг изотопномеченых аминокислот в составе интактных культуральных жидкостей штаммов-продуцентов, содержащих сумму аминокислот и других метаболитов среды, до стадии их хроматографического разделения, а также исследовать включение стабильных изотопов в аминокислоты белковых гидролизатов.

При использовании в качестве источников стабильных изотопов (13С)метанола и 2Н2О, в клетке синтезируются изотопнозамещённые аминокислоты, различающиеся количеством атомов, замещённых на 13С и 2Н. При этом, чем выше молекулярная масса аминокислот, тем возможен больший набор ионов, соответствующих изотопнозамещённым формам. Пики при m/z 323.2; 337.4; 368.5; 382.3; 420.5 в масс-спектре [13С]аминокислот дериватизованной культуральной жидкости M. flagellatum, полученной с водной среды, содержащей 1% (13С)метанол (рис. 2 б), соответствуют по массе метиловым эфирам N-Dns-глицина, N-Dns-аланина, N-Dns-валина, N-Dns-лейцина/изолейцина и N-Dns-фенилаланина. Следует подчеркнуть, что величина m/z для молекулярного иона метиловых эфиров N-Dns-лейцина и изолейцина в масс-спектрах электронного удара одинакова, поэтому данным методом нельзя точно идентифицировать эти аминокислоты. Максимальные уровни включения 13С в молекулы аминокислот, измеренные по увеличению усреднённого значения m/z для молекулярного иона изотопномеченого образца в сравнении с молекулярной массой природной аминокислоты варьируют от 35% для [13C]аланина до 95% для [13С]фенилаланина (табл. 2). Учитывая ауксотрофность штамма по L-изолейцину, разброс значений может быть объяснён вкладом экзогенного L-изолейцина в уровень изотопного включения лейцина, а также других метаболически связанных с ним аминокислот (см. текст ниже). 

Для штамма B. methylicum наблюдалось специфическое возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы индивидуальных аминокислот культуральных жидкостей (табл. 2) при ступенчатом увеличении концентраций 2Н2O в ростовой среде. Уровни включения дейтерия в молекулы разных аминокислот при одинаковых условиях культивирования различаются. Такой результат зафиксирован во всех экспериментах, где источником стабильных изотопов служила 2Н2О.

            Из масс-спектра метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот культуральной жидкости, полученной со среды, содержащей 49% 2Н2О (рис. 3 б) видно, что молекула фенилаланина содержала 6 изотопнозамещённых форм со средним значением m/z 414.2, которое возрастает по сравнению с контрольными условиями (m/z 412.0, рис. 3 а) на 2.2 единицы, т. е. 27.5% от общего количества атомов  водорода в молекуле замещены на дейтерий. Область масс-спектра со значениями m/z 90-300 соответствует продуктам дериватизации метаболитов ростовой среды. Пик с m/z  431.0, зафиксированный в масс-спектре культуральной жидкости и проявляющийся во всех опытах, соответствует продукту дополнительного метилирования фенилаланина по a-NH-(Dns)- группе. Пик с m/z  400 (рис. 3 б) вероятнее всего отвечает продукту отщепления метильной группы от дейтерированного производного фенилаланина.

Присутствие в масс-спектре образца культуральной жидкости B. methylicum, полученной на среде с 73.5% 2Н2О (рис. 4) пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-фенилаланина с m/z 416.1 указывает на увеличение молекулярной массы фенилаланина на 4.1 единицу, т. е., 51.2% атомов водорода в молекуле фенилаланина в этом случае замещены на дейтерий. Очевидно, что вышеобозначенные атомы дейтерия включились в молекулу фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы. К легко обмениваемым следует отнести протоны (дейтероны) при гетероатомах в NH2- и СООН- группах аминокислот, которые замещаются за счёт лёгкости диссоциации в Н2О (2Н2О).

Таблица 2

Уровни включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот, секретируемых в культуральную жидкость (КЖ) B. methylicum и M. flagellatum, и в аминокислотные остатки белков (данные получены для метиловых эфиров N-Dns-аминокислот и N-Cbz-аминокислот)

Из табл. 2 видно, что условиях ауксотрофности по L-лейцину уровни включения 2Н в молекулы лейцина/изолейцина ниже, чем для фенилаланина. Отмеченная особенность отчётливее всего проявляется на среде с максимальной концентрацией 2Н2О. Ещё раз этот результат подтвердили рис. 5, где показан масс-спектр [2Н]аминокислот культуральной жидкости в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот после выращивания бактерий B. methylicum в указанных условиях. Видно, что величина m/z 418.0 пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-фенилаланиа увеличивается по сравнению с контрольными условиями на 6 единиц, что соответствует замещению 75% от общего количества атомов  водорода в молекуле. В отличие от фенилаланина уровень включения дейтерия в лейцин/изолейцин составил 51.0%, а в валин - 58.8%. Примечательно, что в масс-спектре этого образца фиксируется пик обогащённого дейтерием бензильного фрагмента при m/z 97.0 (вместо m/z при 91.0 в контроле), что указывает на частичную локализацию атомов дейтерия в молекуле фенилаланина в положениях С2-С6 ароматического кольца и сопредельном с ними положении при углеродном атоме b. Несмотря на то, что в остальных опытах пики бензильных фрагментов не были зафиксированы, логично предположить, что при других концентрациях 2Н2О дейтерий также включается в ароматическое кольцо фенилаланина, так как в 2Н2О метаболизм у штамма B. methylicum не претерпевает существенных изменений [25]. 

Аналогичная закономерность в уровнях включения 13С в молекулы аминокислот, связанных с ауксотрофным метаболизмом, проявляется при выращивании L-изолейцинзависимого штамма M. flagellatum на среде с 1% (13С)метанолом. Как видно из табл. 2, в отличие от наблюдаемого для [13С]фенилаланина (уровень изотопного включения - 95.0%), уровни включения изотопа 13С в молекулы лейцина/изолейцина, аланина и валина составили 38.0; 35.0; 50.0% соответственно. Уровень изотопного включения для [13C]глицина (60%) хотя и выше, чем для трёх последних аминокислот, но намного ниже, чем для фенилаланина.

            Суммируя полученные данные по уровням включения 2Н-и 13С в молекулы секретируемых аминокислот, можно сделать вывод о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина и метаболически родственных с ним аминокислот de novo. Другим логическим объяснением наблюдаемого эффекта, если принять во внимание происхождение лейцина и изолейцина по различным путям биосинтеза, может быть ассимиляция клеткой немеченого лейцина из среды на фоне биосинтеза меченого изолейцина de novo. Учитывая данные эффекты следует подчеркнуть, что использование ауксотрофных форм микроорганизмов для получения изотопномеченых аминокислот не оправдывает себя практически из-за множественного включения изотопов в молекулы. Напротив, использование для этих целей прототрофных форм микроорганизмов кажется более перспективным.      

Общие принципы изучения уровней изотопного включения в молекулы аминокислот при данном способе введения метки были продемонстрированы на примере анализа сложных мультикомпонентных смесей, полученных после гидролиза суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий, а также индивидуального белка – бактериородопсина, выполняющего роль АТФ-зависимой транслоказы в клетках галофильной бактерии Halobacterium halobium. Как видно из рис. 6, до десяти аминокислот могут быть идентифицированы в гидролизате белка B. methylicum по пикам молекулярных ионов метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот.

Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, пики М+. соответствовали смесям изотопнозамещённых форм аминокислот. Для лизина и тирозина пики М+. соответствовали метиловым эфирам ди-производных аминокислот - a, e-ди-Dns-лизину (с М+. при m/z 631.0) и О, N-ди-Dns-тирозину (с М+. при m/z 663.9). Уровни изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при содержании 2Н2O в ростовой среде 49% варьируют от 25.6%  для тирозина до 45.0%  для аланина (рис. 6 б и табл. 2). В молекулах глицина, валина, фенилаланина, серина, лизина, аспарагиновой и глутаминовой кислот они находятся в пределах 35 - 40%. Что касается других аминокислот, не детектируемых данным методом, очевидно, что уровни изотопного включения в них приблизительно такие же. Это подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методами обращённо-фазовой ВЭЖХ в виде N-Cbz-производных аминокислот или метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот и ионнообменной хроматографии, где детектируется уже 15 аминокислот (см., например, рис. 7).  

Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения стабильных изотопов 2Н и 13С в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы (за исключением лейцина/изолейцина и валина, сниженные уровни включения для которых объясняются эффектом ауксотрофности по L-лейцину и по L-изолейцину). Например, в случае с дейтерированными аминокислотами полного замещения на стабильные изотопы удалось достичь за счет использования в качестве источника дейтерия 98% 2Н2О (табл. 2). Как видно из табл. 2, при росте B. methylicum на среде с 98% 2Н2О, уровни включения дейтерия в остатки глицина, аланина, фенилаланина и тирозина составляют 90.0;  97.5; 95.0 и 92.8%. В  экспериментах по включению изотопа 13С в суммарные белки биомассы за счёт утилизации (13С)метанола метилотрофными бактериями M. flagellatum также наблюдались высокие уровни изотопного включения в глицине (90%), аланине (95.0%) и фенилаланине (80.5%) (табл. 2). Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, сниженные уровни включения стабильных изотопов в лейцине/изолейцине (49%), а также в метаболически связанных с ним аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены эффектом ауксотрофности штамма по L-изолейцину, который добавляли в ростовую среду в немеченом виде.

Страницы: 1, 2, 3