Реферат: Закономірності будови плаценти і лімфоїдної тканини, асоційованої з нею, протягом третього періоду вагітності
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 35 наукових праць, з яких, 25 – у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (7 статей без співавторів), 7 – у матеріалах конференцій, отримано 1 деклараційний патент України на корисну модель і 2 патенти України на корисну модель.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена державною мовою на 396 сторінках, з яких 345 основного тексту, і складається із вступу, 7 розділів, рекомендацій, щодо наукового і практичного використання здобутих результатів, висновків, списку літературних джерел та додатків. Список літературних джерел містить 434 бібліографічний опис, з яких 245 викладено кирилицею, 189 латиною. Робота ілюстрована 69 рисунками, 20 таблицями та 101 фотографією.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Об’єктами дослідження стали плаценти породіль тварин. Враховуючи подвійне походження плаценти, доцільно вивчати окремо материнську і плодову частину плаценти. Беручи до уваги складну будову плаценти використання великої кількості термінів в літературі, при описанн структури дотримувалися Міжнародної гістологічної номенклатури (Гент, Бельгія, 1992).
Дослідження складалося з двох етапів. На першому етапі дослідження будови плаценти і лімфоїдної тканини, асоційованої з нею, вивчалися плаценти породіль з фізіологічним перебігом вагітності і після зміненої імунологічної реактивності материнського і плідного організмів. Досліджено 126 доношених плацент породіль. Були сформовані чотири групи дослідження: перша група – жінки, які мали в анамнезі антигенний вплив протягом третього періоду вагітності, що було зафіксовано в картах пологів, але, згідно патологоанатомічному дослідженню, не мали запального процесу в плаценті та плідних оболонках. Друга група – група порівняння – плаценти жінок з фізіологічним перебігом вагітності. Третя група – плаценти жінок з резус–несумісністю, без наявності ознак гемолітичної хвороби у плодів новонароджених та відсутністю патологічного процесу в плаценті. Четверта група група порівняння – плаценти жінок з фізіологічним перебігом вагітності і без ознак гемолітичної хвороби у плодів і новонароджених.
Комісією з етичних питань та біоетики Запорізького державного медичного університету (протокол № 3 від 17.04.2008 р.) встановлено, що проведені дослідження відповідають принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною Асамблеєю Всесвітньої медично асоціації (2000 р.), Конвенцією Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних, наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983 р.) та законам України.
Другим етапом дослідження морфогенезу плаценти і її лімфоїдної тканини стали плаценти щурів. Плацента щурів за розвитком та будовою подібна до плаценти людини (дископодібна, хоріонічна, гемохоріальна), що дозволяє проводити порівняльний аналіз їх будови. При дослідженні експериментально отриманого матеріалу вивчали плаценти щурів, отриманих з „Біомодельсервісу” (м. Київ) з ветеринарним свідоцтвом про стан здоров’я тварин для подальшого утримання в умовах віварію згідно рекомендацій Ю.М. Кожем’якіна та ін. (2000). Догляд за тваринами здійснювали за спеціальними нормами і вимогами, розробленими згідно етичного кодексу Ради Міжнародних медичних організацій „Міжнародні рекомендації для проведення медико–біологічних досліджень із застосуванням тварин”. Забій тварин проводили шляхом декапітації після ефірного наркозу.
Об’єктом експериментального дослідження стали 146 плацент щурів племені Vistar на 18–у, 20–у, 22–у добу вагітності та на час пологів. На кожен строк дослідження забирали плаценти двох–трьох приплодів. Кількість плодів і новонароджених в приплодах становила 5–6 тварин. Тварини були поділені на п’ять груп. Перша група – інтактна. Друга експериментальна група представлена тваринами, яких імунізували комерційним стафілококовим анатоксином (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва) за методикою В. А. Сіліна та ін. (1981). Третя група контрольна – плаценти тварин, яким уводили фізіологічний розчин замість стафілококового анатоксину. Четверта експериментальна група – плаценти, що отримані від тварин, плодам яких уводили імуноглобулін за методикою М.А. Волошина (1981). П’ята група – контрольна по відношенню до четвертої, тваринам замість імуноглобуліну уводили фізіологічний розчин.
Дослідження плацент породіль тварин починалося з огляду. До морфометричних показників відносили: масу плацент, її розміри, діаметр і об’єм плацент. Вимірювалася маса плодів новонароджених, їх довжина тіла, обчислювався відносний показник: маса плаценти/маса плоду, або новонародженого і, відповідно, – плацентарно–плодовий коефіцієнт. Вимірювали товщину плодової і материнської частини.
Для гістологічного дослідження брали шматочки плаценти породіль розмірами 2х2 см з центральної зони плаценти, а плаценти тварин забиралися повністю. Отриманий матеріал від людини фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну (pH 7,0), при кімнатній температур протягом 5–6 діб, або у рідині Карнуа. Анатомо–експериментальний матеріал фіксували в розчині Буена, абсолютному спирті і розчині Карнуа. Виготовляли 150–200 серійних зрізів, товщиною 5 мкм.
Для оглядової мікроскоп проводили фарбування зрізів гематоксиліном і еозином, ШЙК–реакцію з додатковим фарбуванням ядер гематоксиліном Караці. Підраховували абсолютну площу, що припадає на строму ворсин, цито– і синцитіотрофобласт, синцитіальні вузли материнські лакуни в плаценті людини на 10000 мм2. Проводили гістометрію підрахували відносну площу, що припадає на відкладання фібриноїду, материнськ лакуни, плодові судини і сполучнотканину строму трабекул плаценти щурів. Для вивчення розподілу фібриноїду фібринового і матриксного типу гістологічні зрізи фарбували за Маллорі. Для специфічного виявлення вуглеводного компоненту композитів фібриноїду проводили лектингістохімічну реакцію з набором лектинів: кори бузини чорної (SNA), зародків пшениці (WGA), сої (SBA), ікри окуня (PFA), арахісу (PNA).
Для вивчення особливостей розподілу колагенів в плацентарних структурах проводили імпрегнацію сріблом за Лейдлоу. Лектингістохімічним методом досліджували розподіл колагенів III, V VI типів з використанням комерційного набору „Лектинтест” (м. Львів). Для муногістохімічного дослідження колагену ІV типу (n=40) використовували первинн антитіла (DAKO) і систему візуалізації LSAB (Labelled Streptavidin-Biotin).
Для дослідження відкладень антирезусних імунних комплексів на поверхні ворсин цитотрофобласту застосовували лектингістохімічний метод, з використанням лектину еритроаглютинину. Площу відкладень антирезусних комплексів вираховували на площу 10000 мкм2. Кількісну оцінку результатів лектингістохімічної реакції проводили методом комп’ютерної морфометрії та мікроденситометрії за допомогою ліцензійної коп комп’ютерної програми „Відеотест – Размер 5.0” (ООО Видеотест, Россия).
Для вивчення дендритних клітин лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою, шматочки плаценти фіксували у випарах рідкого азоту. Виготовляли кріостатні зрізи товщиною 10 мкм, виявляли дендритні клітини за допомогою реакції на АТФ–азу (за методом Вахштейна–Мейзеля). Одночасно, дендритні клітини виявляли за допомогою лектинів сочевиці (LCA) і конконоваліну А (Con A).
Для кількісного і якісного вивчення лімфоцитів плаценти, використовуючи морфометричну сітку Глаголєва в модифікації С.Б. Стефанова, підраховували загальну кількість лімфоцитів в децидуальній пластинці матки і в стромі ворсин хоріальної частини плаценти на умовну одиницю площі 10000 мкм2 при імерсійному збільшені мікроскопа (об. 100, ок.10). Для виявлення цитотоксичних лімфоцитів використовували альціанове забарвлення при критичній концентрації електроліта MgCl2 0,6М. Для вивчення розподілу плазматичних клітин проводили фарбування за Браше. Для виявлення лімфоцитів, які фенотипічно розрізняються за вуглеводними залишками, проводили дослідження із застосуванням лектинів арахісу (PNA), сої (SBA) та слимака (HPA).
Для дослідження популяц цитотоксичних лімфоцитів в плаценті аналізували рівень експресії маркера СD8+ на лімфоцитах (n=50); популяції В1–лімфоцитів – маркер СD5+ (n=75) в муногістохімічних реакціях з моноклональними антитілами виробника DakoCytomation (Denmark – USA).
Мікрофотографування досліджуваних об’єктів виконано на відеосистемі „Aksiolap” (“Carle Ceis”, Німеччина).
Облік морфологічних ознак проводили методом морфологічного урахування структур за С.Б. Стефановим. Статистичну обробку отриманих числових результатів проводили методами варіаційної статистики. Для перевірки наявності зв’язку між перемінними, як були отримані, застосували кореляційний аналіз (коефіцієнт кореляції Пірсона). Достовірність різниці між групами оцінювали за методом Стьюдента–Фишера для порогу вірогідності результатів не менше 95%, що є загальноприйнятою в біологічних і медичних розрахунках (р<0,05).
Результати дослідження та їх аналіз. При досліджен морфо–функціональних змін в системі "мати–плацента–плід", внаслідок антигенної стимуляції протягом третього періоду вагітності і при ізоімунній несумісності по резус фактору, встановлено, що вони залежать від реактивност мунної системи материнського і плідного організмів.
Плаценти групи жінок, які мали антигенний вплив протягом третього періоду вагітності і резус–несумісність, частіше, ніж у контролі, мали неправильну форму. У породіль з антигенним впливом виявлялось зростання середньої маси плацент 506,1±11,58 г, в груп порівняння – 486,0±16,41 г і збільшення товщини плодової частини плаценти до 16,50±1,00 мм; при резус–несумісності відбувалося збільшення її площ 349,5±1,66 мм2, в групі порівняння 331,98±14,71 мм2 і потовщення материнсько частини плаценти до 14,50±1,10 мм. В першій групі спостереження, після антигенного впливу на організм вагітної, відбувалося зменшення площини лакун до 445,72±45,58 мм2, в другій групі порівняння цей показник становив 524,82±9,68 мм2.
Материнські поверхні плацент жінок з резус–несумісністю часто мали неправильну форма. Товщина, розміри розташування часточок відрізнялися значною варіабельністю.
При порівнянні гістологічних особливостей базальної пластинки першої групи і другої групи спостереження відзначено, що більшість плацент жінок (95 %) після антигенного тиску протягом третього періоду вагітності мають осередкові скупчення лімфоцито–макрофагальних клітин. В групі порівняння вони також є, але розташовуються дифузно, навколо якірних ворсин. Основна відпадна оболонка плацент третьої групи спостереження (резус–несумісність) рівномірно кровонаповнена і містить велику кількість фібриноїду.
В плаценті жінок з антигенною дією протягом третього періоду в товщі хоріоничної пластинки доволі часто виявляються осередки лейкоцито–лімфоцитарних інфільтратів (75 %, проти 40 % у контролі). Шар Лангханса хоріонічної пластинки є потовщеним (у 80 % випадків, проти 45 % у групі порівняння). При ізоімунній несумісності по резус–фактору він також представлений товстим шаром фібриноїда і хоріонічна пластинка завжди має нерівномірну товщину.
Проявом компенсаторно–пристосувальних механізмів в плаценті, на тлі дії антигенів на організм вагітної і зростання кількості лімфоцитів в ній, є зміна форми ворсин. Вони мають виражені вигини контурів, які включають численні опуклості та нвагінації, що надає таким ворсинам виду неправильної, зім’ятої форми. Одночасно такі ворсини є багатими на лімфоцити малого діаметру, особливо в прошарку синцитія.
Абсолютна площа, яка припадає на синцитіо– і цитотрофобласт в першій групі жінок (антигенний тиск на вагітну протягом останнього триместру вагітності), становить 343,06,±67,68 мм2 абсолютної площі, в другій групі порівняння – 358,32±26,37 мм2. Абсолютна площа, що припадає на синцитіальні вузли в третій групі (резус–несумісність), становить 152,59±16,27 мм2, в контролі (четверта група) – 174,19±15,29 мм2.
Площа нашарувань антирезусних мунних комплексів в плацентах при резус–несумісності становить 240,76±23,09 мкм2. В плацентах групи порівняння – 182,62±23,56 мкм2. При порівнянн щільності таких нашарувань в одиницях яскравості, в третій групі цей показник становить – 308,55±45,09 одиниць, а в контролі – 152,34±34,00 одиниць.
Останнім часом особлива увага морфологів, ембріологів, клініцистів приділяється процесу колагенезу в плацент (Ситнікова В.О., 2004). При досліджені накопичення колагенових волокон, пофарбованих за Маллорі, встановлено, що в плацентах з антигенним впливом, в більшості випадках, волокна розрихлені, розпушені і потовщені.
У плацентах жінок з фізіологічним перебігом вагітності і без резус-несумісності колагенові волокна при виявленн х імпрегнацією азотнокислим сріблом за Лейдлоу мають вигляд лінійних, довгих, звивистих волокон світло–коричневого кольору, товщиною до 5 мкм. Волокна світло–коричневого кольору ідентифікуються як колаген І типу. В стром стовбурових ворсин вони щільно прилягають одне до одного, утворюючи пучки.
При дослідженні плацент породілей з вірогідним антигенним впливом, встановлено, що в стромі ворсин зроста експресія колагену I типу (++), порівняно з плацентами жінок другої групи (+). Спостерігається огрубіння цих волокон, щільність їх зростає, окремі волокна майже не розрізняються. Нерівномірне потовщення і огрубіння волокон колагену I типу також спостерігається в децидуальній пластинці.
При дослідженні розподілу колагену III типу за Лейдлоу в плацентах з фізіологічним перебігом вагітності, його волокна є тонкими і ніжними, порівняно з волокнами колагену I типу. Вони злегка звивисті, чорного кольору, товщиною до 1 мкм, радіально розташовані в товщ стінок судин стовбурових ворсин. В децидуальній пластинці вони локалізуються навколо судин і утворюють дрібнопетельний візерунок.
У жінок першої групи – з обтяжливим діагнозом, експресія колагену III типу в плаценті переважає (++), порівняно з плацентами жінок контрольної групи (+). Волокна, частіше, ніж в нормі, потовщені; спостерігається їх фрагментація, розщеплення та огрубіння. В децидуальній пластинці волокна чорного кольору зберігають петельний малюнок в стінках судин. Отримані дані співпадають з клінічними даним інших авторів (Назаренко Л.Г., Неєлова О.В., 2006; Задорожна Т.Д., Жук В.Ю., 2007).
При дослідженні колагену III типу лектингістохімічним методом встановлено, що топографія волокон співпадає з локалізацією волокон чорного кольору після імпрегнації сріблом. Оскільки приєднання лектину окуня після гідролізу відбувається до рецепторів–лігандів, розташованих на глікопротеїновій оболонці колагену III типу, волокна мають більш потовщений, огрубілий вигляд, ніж після імпрегнації сріблом, і завтовшки 3–5 мкм. Збільшення накопичення, ніж в нормі, колагену III типу просліджується в плацентах жінок першої і третьої груп (++, +++, відповідно). PFA+–волокна колагену III типу мають товщину до 7 мкм. Найчастіше вони фрагментовані й мають розщеплений характер.
При вивченні розподілу колагену IV типу, імуногістохімічним методом при фізіологічно перебігаючій вагітност встановлено, що інтенсивне накопичення колагену визначається в базальній мембран судин ворсинчастого трофобласту (+++), базальній мембрані епітелію синцитіотрофобласту (+++), у складі міжворсинчатого фібриноїду та стром ворсин, особливо стовбурових. В структурі базальної мембрани судин хоріону колаген IV типу нашаровується у вигляді суцільної смужки, товщиною 1,5–2 мкм. В товщі базальної мембрани синцитіотрофобласту утворює суцільну смугу, товщиною 2-3 мкм, яка має нерівний, розшарований контур.
У складі міжворсинчастого фібриноїду, який нашаровується на поверхні ворсин, колаген IV типу має вигляд аморфних мас. Особливо інтенсивне відкладання колагену IV типу у склад фібриноїду відбувається на поверхні синцитіокапілярних мембран.
У плацентах першої групи (інфекційний процес у жінок протягом третього періоду вагітності) в структур мембран синцитіотрофобласту колаген IV типу виявляється у вигляді грубих, розволокнених смужечок, порівняно з другою групою плацент. В місцях синцитіальних вузлів колаген IV типу відсутній в структурі базальних мембран. У складі фібриноїду ворсинчастого хоріону і основної відпадної оболонки нтенсивність накопичення колагену IV типу вища, порівняно з контрольною другою групою (+++).
У разі вивчення розподілу колагену V типу лектингістохімічним методом, встановлено, що топографія тоненьких (до 1 мкм завтовшки), звивистих, довгих, світло–коричневих SBA+–волокон співпадає з локалізацією волокон коричневого кольору після імпрегнації сріблом. В сполучнотканинній стромі стовбурових ворсин вони локалізуються навколо стінок судин, або вільно, неупорядковано розташовуються в сполучній тканині. В проміжних ворсинах вони ще тонші, звивисті і їх можна підраховувати (8–10 волоконець). В термінальних ворсинах їх або не видно, або вони ледь контуруються. В децидуальній пластинці майже не візуалізуються SBA+–волокна, але вони добре ідентифікуються в стромі якірних ворсин. В плацентах жінок після перенесеного гострого респіраторного захворювання протягом третього періоду вагітності інтенсивність експресії колагену V типу дещо вища.
