Реферат: Вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на патогенез експериментального цукрового діабету
При введенн культури гемопоетичних стовбурових клітин (4 група) спостерігалося різке збільшення проліферації клітин в ендокринній частині залози в 9,9 разів (p<0,05) на 45 добу і в 5,5 разів (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із тваринами 1 групи. Кількість острівців на одиницю площі на 45 і 70 добу збільшується у 2,1 (p<0,05) і 2,3 (p<0,001) рази у порівнянні із тваринами 1 групи, але статистично не відрізняється від інших груп. Така висока проліферативна активність у поєднанні з неогенезом острівців призвела до збільшення питомого об’єму острівкової тканини в 3,1 рази (p<0,05) на 45 добу і в 5,0 разів (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із тваринами 1 групи. Також зросла й середня площа острівця: на 45 добу вона була в 1,1 рази (p<0,05) більше, на 70 добу – в 2,3 рази (p<0,001) більше у порівнянні з 1 групою, при цьому зустрічалися гігантські острівці із площею до 37000 мкм2. Питомий об’єм бета-клітин на 45 добу був найнижчим серед усіх груп, від складав 22,1±2,6% при найбільшій кількості ані альфа-, ані бета-клітин – 46,09±3,32%. Але на 70 добу питомий об’єм бета-клітин був достовірно (p<0,001) найвищим (77,6±1,7%) серед всіх груп, а питомий об’єм альфа-клітин – достовірно найнижчим (співвідношення бета- до альфа-клітин дорівнювало 4,0), при цьому кількість інших (ні альфа-, ні бета-) клітин залишалася досить високою (2,93±1,17%), але значно нижчою, ніж у тварин 1 групи. Ці зміни призвели до зростання середньої кількості інсулін-позитивних клітин на одиницю площі в 3,0 рази (p<0,05) на 45 добу і в 6,2 рази (p<0,001) на 70 добу у порівнянн з 1 групою. У той же час підвищення рівня інсуліну на 70 добу склало 16 разів (p<0,001), що призвело до зниження рівня глюкози до 5,82±0,80 ммоль/л, що в 1,7 рази (p<0,001) менше ніж у тварин 1 групи і в 1,4 рази (p<0,001) вище ніж у інтактних тварин. Такі зміни призвели до поліпшення показників дисліпідемії. Відмінності від групи тварин без трансплантації на 70 добу експерименту були значними й достовірними. Так рівень ТГ був в 2,4 рази нижче (p<0,001), ЗХ – в 1,5 рази нижче (p<0,001), холестерину ЛПНЩ – в 2,3 рази нижче (p<0,001), холестерину ЛПВЩ – в 1,4 рази вище (p<0,01), ІА – в 3,2 рази нижче (p<0,001). У порівнянні із інтактними тваринами рівень холестерину ЛПНЩ був лише в 1,2 рази (p<0,05) вище, ІА – в 1,3 рази (p<0,01), у той же час рівні ТГ, ЗХ і холестерину ЛПВЩ достовірно не відрізнялися (p<0,05). Зниження рівня глюкози і ступеня порушень обміну жирів відбилося у практично повному призупиненні розвитку мікроангіопатії. На 70 добу експерименту у порівнянні із тваринами, що не одержували лікування, середня товщина стінки прекапілярних артеріол була в 1,6 рази менше (p<0,01), а відносна товщина – в 1,4 рази менше (p<0,001), середня й відносна товщина стінки артеріол були в 1,4 і 1,3 рази менше (p<0,001 для обох показників), середня і відносна товщина стінки дрібних артерій виявилися в 1,5 рази менше (p<0,001 для обох показників). У порівнянні з даними на 30 добу (перед трансплантацією) усі показники були нижчими, достовірно тільки абсолютна товщина артеріол була нижчою. Тобто, трансплантація стовбурових тканини повністю призупиняє розвиток мікроангіопатії, принаймні у строки нашого дослідження.
Таким чином, після трансплантації культури стовбурових клітин спостерігалось різке прискорення проліферації острівкових клітин. При цьому кількість бета-клітин на 45 добу була найнижчою серед усіх груп при найбільшій кількості ані альфа-, ан бета-клітин. Це можна пояснити тим, що у даний термін відбувається 1 етап регенерації – проліферація клітин. Найбільш наочно цей феномен був висвітленим після потрійного імунозабарвлення: на 45 добу більшість клітин, що проліферують, не експресують інсуліну у цитоплазмі. Але до 70 доби етап проліферації змінюється на етап диференціювання: при потрійному мунозабарвленні є наявним, що більшість клітин, що проліферують, нсулін-позитивними.. Отже, трансплантація культури клітин ПШЗ призводить до прискорення регенерації острівкових клітин за механізмом, що є подібним до репаративної регенерації і складається із 2 етапів – проліферац диференціювання.
Висновки
У дисертаційний роботі проведено теоретичне узагальнення та експериментальне вирішення науково проблеми встановлення впливу трансплантації культур острівкових клітин підшлункової залози і гемопоетичних стовбурових клітин на перебіг експериментального цукрового діабету у щурів із визначенням змін у вуглеводному, ліпідному обміні, у морфологічному стані підшлункової залози та артеріальних судин.
1. Внутрішньочеревна трансплантація культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин, трансплантація живої культури ксеногенних клітин підшлункової залози зруйнованої культури ксеногенних клітин підшлункової залози щурам із експериментальним цукровим діабетом призводять до поліпшення всіх досліджених показників перебігу цукрового діабету. Найбільш ефективними методами на 70 добу експерименту були одноразова трансплантація культури гемопоетичних стовбурових клітин і дворазова трансплантація живої культури клітин підшлункової залози.
2. На 40 добу після дворазової трансплантації культури клітин підшлункової залози трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин рівень інсуліну крові зростає в 11 разів і 16 разів, відповідно, а рівень глікемії знижується відповідно в 1,6 рази і 1,7 рази, але він залишається в обох групах в 1,4 рази більше, ніж у нтактних тварин.
3. Після дворазової трансплантації живої культури клітин підшлункової залози трансплантації культури гемопоетичних стовбурових клітин на 40 добу у порівнянні із тваринами з експериментальним цукровим діабетом, яким трансплантацію не виконували, спостерігається збільшення питомого об’єму острівкової тканини в 3,2 рази і 5,0 разів, відповідно, а збільшення кількост клітин, що синтезують інсулін, на одиницю площі залози склало 4,1 і 6,2 разів відповідно.
4. В умовах експериментального цукрового діабету деякі ацинарні екзокринні клітини та клітини проток підшлункової залози набувають здатність до синтезу інсуліну. На 30 добу алоксанового діабету середня кількість кластерів клітин, що формуються з ацинарних екзокринних клітин, які набули здатність синтезувати інсулін, на 10 мм2 зрізу склала 2,96±0,59, а середня кількість клітин у кластер дорівнювала 4,42±0,51. У групі інтактних тварин такі кластери знайдені не були. Після трансплантації клітинних культур середня кількість таких кластерів на одиницю площі залози достовірно не відрізнялась від тварин без трансплантації.
5. Після дворазової трансплантації культури клітин підшлункової залози і трансплантац гемопоетичних стовбурових клітин рівень тригліцеридів зменшується відповідно в 2,0 рази і 2,4 рази, загального холестерину – в 1,3 рази і 1,5 рази, холестерину ЛПНЩ – в 1,3 рази і 2,3 рази, індексу атерогенності – в 2,2 рази 3,2 рази, а рівень холестерину ЛПВЩ збільшується в обох групах в 1,4 рази у порівнянні із тваринами з цукровим діабетом, яким трансплантацію не виконували. Трансплантація культури стовбурових клітин призводить до найбільш виражено корекції дисліпідемії. Після виконання цього виду трансплантації рівн тригліцеридів, загального холестерину і холестерину ЛПВЩ достовірно не відрізняються від рівня інтактних тварин.
6. Трансплантац усіх використаних видів клітинних культур гальмують розвиток діабетично мікроангіопатії. Наприкінці експерименту у тварин з дворазовою трансплантацією культури клітин підшлункової залози і гемопоетичних стовбурових клітин відносна товщина стінки прекапілярних артеріол серця була в 1,3 рази і 1,4 рази менше, стінки артеріол – в 1,2 рази і 1,3 рази менше, дрібних артерій – в 1,2 рази 1,5 разів менше, відповідно, ніж у тварин без трансплантації. Введення клітин підшлункової залози призвело до неповного гальмування розвитку мікроангіопатії. Після дворазової трансплантації абсолютна і відносна товщина дрібних артерій відносна товщина артеріол залишились більшими в 1,1 рази, ніж перед трансплантацією на 30 добу, інші показники достовірно не збільшились. Трансплантація культури стовбурових гемопоетичних клітин призводить до повного зупинення розвитку мікроангіопатії, усі показники достовірно не збільшились у порівнянні з даними на 30 добу, а абсолютна товщина стінки артеріол зменшилась в 1,2 рази.
7. Одержан результати є експериментальним обґрунтовуванням доцільності застосування трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових гемопоетичних клітин для корекції перебігу інсулін-залежного цукрового діабету.
Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Єльський В.М., Селезньова О.В., Зінкович І.І., Федорова А.О. Вплив трансплантац клітинних культур на виразність діабетичної дисліпідемії // Ендокринологія.–2006.–Т.11, №2.–С.175-180. (Здобувачка вивчила зміни показників ліпідного обміну. Спільно з співавторами виконано обговорення результатів формулювання висновків).
2. Єльський В.М., Селезньова О.В., Зінкович І.І. Вплив трансплантації клітинних культур на вираженість діабетичної мікроангіопатії в експерименті // Клін. експерим. патологія.–2007.–Т.6, №1.–С.40-46. (Здобувачкою проведено морфометричний аналіз товщини стінок судин, обробка результатів. Спільно з співавторами виконано обговорення результатів і формулювання висновків).
3. Єльський В.М., Зінкович І.І., Селезньова О.В. Вплив трансплантації клітинних культур на основні показники вуглеводного обміну при експериментальному цукровому діабет // Ендокринологія.–2007.–Т.12, №2.–С.276-286. (Здобувачка вивчила зміни показників вуглеводного обміну. Спільно з співавторами виконано обговорення результатів і формулювання висновків).
4. Єльський В.М., Селезньова О.В. Динаміка морфологічних змін у підшлунковій залозі тварин з експериментальним цукровим діабетом після трансплантації клітинних культур // Загальна патологія та патологічна фізіологія.–2007.–Т.2, №2.–С.72-75. (Здобувачкою виконано морфометричний аналіз підшлункової залози, обробка результатів і їх аналіз. Спільно з співавтором виконано обговорення результатів формулювання висновків).
5. Єльський В.М., Селезньова О.В., Зінкович І.І. Вплив трансплантації клітинних культур на стан острівкового апарата пацюків з експериментальним цукровим діабетом // Патологія.–2006.–Т.3, №2.–С.43-49. (Здобувачкою виконано морфометричний аналіз підшлункової залози. Спільно з співавторами виконано обговорення результатів формулювання висновків).
6. Селезнева Е.В. Современные представления о морфогенезе и регенерации островкового аппарата поджелудочной железы // Вестник неотложной и восстановительной медицины.–2005.–Т.6, №1.–С.151-154.
7. Селезнева Е.В., Зинкович И.И. Влияние трансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы на течение экспериментального сахарного диабета у крыс // Мат. конф. “Гомеостаз: физиология, патология, фармакология и клиника”.–2005.–Одеса.–С.206-209. (Здобувачкою виконано морфометричний аналіз підшлункової залози і стінок артеріальних судин серця. Спільно з співавтором виконано формулювання висновків).
8. Ельский В.Н., Зинкович И.И.., Селезнева Е.В. Состояние основных показателей жирового обмена у животных с экспериментальным сахарным диабетом после трансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы // Фізіол. журн.–2006.–Т.52, 2.–С.122. (Здобувачка вивчила зміни показників ліпідного обміну. Спільно з співавторами виконано формулювання висновків).
9. Селезнева Е.В. Влияние трансплантации стволовых клеток на регенерацию панкреатических островков // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения.–2006.–Т.142, №3.–С.248.
10. Селезнева Е.В., Зинкович И.И. Эффект трансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы на течение экспериментального сахарного диабета // Мат. наук.-практ. конференції “IV читання м.В.В.Підвисоцького”.–2005.–Одеса.–С.88-89. (Здобувачка вивчила зміни показників вуглеводного і ліпідного обміну. Спільно з співавтором виконано формулювання висновків).
11. Селезнева Е.В. Связь биохимических и морфологических показателей после трансплантации культуры клеток поджелудочной железы у крыс с аллоксановым диабетом // Мат. IX Українського біохім. з’їзду.–2006.–Т.2.–С.146.
12. Зінкович І.І., Єльський В.М., Селезньова О.В. Ступінь корекції діабетичної дисліпідем при експериментальному цукровому діабеті після трансплантації культур клітин підшлункової залози // Ендокринологія.–2007.–Т.12 (додаток).–С.80. (Здобувачка вивчила зміни показників ліпідного обміну. Спільно з співавторами виконано формулювання висновків).
13. Зінкович І.І., Селезньова О.В. Вплив трансплантації клітинних культур на розвиток діабетичної мікроангіопатії // “VI читання ім. В.В. Підвисоцького”: Бюлетень матеріалів наук. Конференції (31 травня – 1 червня 2007 р).–Одеса.–2007.–С.66-67. (Здобувачкою виконано морфометричний аналіз товщини стінок судин. Спільно з співавтором виконано формулювання висновків).
Анотації
Селезньова О.В. Вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на патогенез експериментального цукрового діабету. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.04 патологічна фізіологія. – Луганський державний медичний університет. Луганськ, 2008.
Дисертаційна робота присвячена удосконаленню знань про вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози й стовбурових гемопоетичних клітин на патогенез експериментального алоксанового цукрового діабету у щурів. Вивчені особливост вуглеводного, жирового обміну, морфологічних змін в ендокринній частин підшлункової залози, вираженості діабетичної мікроангіопатії після трансплантації. Встановлено, що внутрішньочеревна трансплантація цих культур призводить до поліпшення всіх досліджених показників: зниженню рівня гіперглікемії та дисліпідемії, підвищенню рівня інсуліну, гальмуванню розвитку мікроангіопатії. Основою цих змін є прискорення регенерації ендокринної тканини підшлункової залози, що відбивається зростанням питомого об’єму острівково тканини і кількості клітин, що синтезують інсулін. Також показано, що механізми впливу є різними для вивчених культур. Отримані результати є експериментальним обґрунтовуванням доцільності застосування трансплантації зазначених культур клітин для корекції перебігу інсулін-залежного цукрового діабету.
Ключові слова: цукровий діабет, клітинні культури, стовбурові клітини, трансплантація, патогенез.
Аннотация
Селезнева Е.В. Влияние трансплантации культур клеток поджелудочной железы и стволовых клеток на патогенез экспериментального сахарного диабета. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.04 патологическая физиология. – Луганский государственный медицинский университет. Луганск, 2008.
Работа посвящена усовершенствованию знаний о влиянии трансплантации клеточных культур поджелудочной железы и стволовых гемопоэтических на патогенез экспериментального сахарного диабета. Изучены особенности углеводного, липидного обмена, морфологических изменений в эндокринной части поджелудочной железы, выраженность диабетической микроангиопатии после трансплантации.
Установлено, что трансплантация культуры аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и трансплантация ксеногенной клеточной культуры поджелудочной железы (живой и разрушенной) приводят к коррекции всех изученных показателей, отражающих тяжесть течения сахарного диабета. Наиболее эффективными на конец эксперимента оказались трансплантация культуры стволовых клеток и двукратная трансплантация живой культуры островковых клеток поджелудочной железы.
На 40 день после двукратной трансплантации культуры клеток поджелудочной железы и стволовых клеток уровень инсулина вырос в 11 и в 16 раз, соответственно, а уровень гипергликемии снизился в 1,6 раз і 1,7 раз, соответственно. По сравнению с группой без трансплантации наблюдалось увеличение удельного объема островковой ткани в 3,2 раза и в 5 раз, соответственно, а количество инсулин-продуцирующих клеток на единицу площади увеличилось в 4,1 раз и 6,2 раз, соответственно.
В условиях экспериментального сахарного диабета некоторые ацинарные экзокринные и протоковые клетки приобретают способность синтезировать инсулин. На 30 день аллоксанового диабета среднее количество кластеров, сформировавшихся из ацинарных экзокринных клеток, которые приобрели способность продуцировать инсулин, на 10 мм2 среза составило 2,96±0,59, а среднее количество клеток в кластере было 4,42±0,51. В группе интактных животных такие кластеры отсутствовали. После трансплантации клеточных культур среднее количество таких кластеров на единицу площади железы достоверно не отличалось от такового у животных без трансплантации.
После двукратной трансплантации культуры клеток поджелудочной железы и однократной стволовых гемоэтических клеток уровень триглицеридов снизился соответственно в 2,0 раза и 2,4 раза, общего холестерина – в 1,3 раза и 1,5 раза, холестерина ЛПНЩ – в 1,3 раза и 2,3 раза, индекс атерогенности – в 2,2 раза и 3,2 раза, а уровень холестерина ЛПВЩ в обоих группах вырос в 1,4 раза по сравнению с животными без трансплантации. Трансплантация культуры стволовых клеток приводит к наиболее выраженной коррекции дислипидемии. В результате данного вида трансплантации уровень триглицеридов, общего холестерина и холестерина ЛПВЩ достоверно не отличались от показателей интактных животных.
Трансплантации всех видов клеточных культур приостанавливают развитие диабетической микроангиопатии. В конце эксперимента после двукратной трансплантации культуры клеток поджелудочной железы и стволовых гемопоэтических клеток относительная толщина стенки: прекапилярных артериол сердца была в 1,3 раза и 1,4 раза меньше, артериол – в 1,2 раза і 1,3 раза меньше, мелких артерий – в 1,2 раза и 1,5 раз меньше, соответственно, чем у животных без трансплантации. Введение клеточной культуры поджелудочной железы привело к значительной приостановке развития микроангиопатии. После двукратной трансплантации только абсолютная и относительная толщина мелких артерий и относительная толщина артериол были в 1,1 раз больше по сравнению с данными перед трансплантацией, остальные показатели достоверно не увеличились. Трансплантация культуры стволовых гемопоэтических клеток приводит к полной остановке развития микроангиопатии, все показатели достоверно не увеличились по сравнению с данными перед трансплантацией, а абсолютная толщина стенки артериол уменьшилась в 1,2 раз.
Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием целесообразности применения трансплантации культур клеток поджелудочной железы и стволовых гемопоэтических для коррекции течения инсулин-зависимого сахарного диабета.
Ключевые слова: сахарный диабет, клеточные культуры, стволовые клетки, трансплантация, патогенез.
The summary
Seleznyova O.V. Influence of pancreatic islet and stem cell cultures’ transplantation on pathogenesis of experimental diabetes mellitus. – Manuscript.
Thesis for a candidate degree of biological sciences on speciality 14.03.04 – pathological physiology. – Lugansk State Medical University. – Lugansk, 2008.
The thesis is devoted to evaluation of an influence of pancreatic islet and stem cell cultures’ transplantation on pathogenesis of an experimental diabetes mellitus in rats. It was found peculiarities of carbohydrates and lipids metabolism, changes in morphology of endocrine part of pancreas and diabetic microangiopathy severity after cell transplantation. It’s stated that intraperitoneal transplantation of mentioned cultures’ leads to improving of all investigated data: decreasing of hyperglycemia and dislipidemia, increasing of insulin level, inhibiting of microangiopathy progress. The basis of these changes is acceleration of endocrine pancreas tissue regeneration that appears as elevation of specific volume of islet tissue and number of insulin-producing cells. It was shown that mechanisms of investigated cell cultures influence are different. The obtained results are experimental foundation for usage of cell cultures’ transplantation for treatment of insulin-dependent diabetes mellitus.
Key words: diabetes mellitus, cell culture, stem cells, transplantation, pathogenesis.
Перелік умовних скорочень
ВООЗ – Всесвітня Організація Охорони Здоров’я
ГЛЮТ – глюкозний транспортер
ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота
ЗХ – загальний холестерин
ІА – індекс атерогенності
ІЗЦД нсулінозалежний цукровий діабет
ІНЦД нсулінонезалежний цукровий діабет
ІСК – клітини, що синтезують інсулін
ЛПВЩ ліпопротеїди високої щільності
ЛПДНЩ ліпопротеїди дуже низької щільності
ЛПНЩ ліпопротеїди низької щільності
ЛФ – лужна фосфатаза
мРНК – матрична рибонуклеїнова кислота
ПШЗ підшлункова залоза
ТГ – тригліцериди
ЦД – цукровий діабет
ЦК – цитокератин
DAPI 4',6-діаміно-2-феніліндолдігідрохлорід
FITC – флуоресцину ізотіоціанат
PCNA – ядерний антиген клітин, що проліферують
PE – фікоеритрин
