Реферат: Вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на патогенез експериментального цукрового діабету

Культуру острівкових клітин кроля отримували за наступною схемою (Шумаков В.И. и др., 1995): видалення у кроля віком 2 тижні підшлункової залози, пунктирування протоку із введенням 0,25% розчину трипсину, механічна дезагрегація і глибока трипсинізація, центрифугування. Після видалення супернатанту у клітинний осад додавали поживне середовище Ігла. Життєздатність клітин перевіряли у камер Горяєва із одномоментним підрахунком їх кількості. Концентрація життєздатних клітин в 1 мл суспензії становила 2,5 млн/мл. Далі первинну суспензію розводили та розділяли на порції по 0,3 мл, кожна з котрих містила 50 тис. клітин. Культуру терміново вводили щурам-реципієнтам. Встановлено, що культура острівкових клітин ПШЗ містила 73,7% бета-клітин, 20,6% – альфа-клітин і 5,7% нших клітин.

Визначення рівня глюкози, ТГ, ЗХ і холестерину ЛПНЩ і ЛПВЩ проводили на напівавтоматичних біохімічних аналізаторах. Індекс атерогенності (ІА) розраховували за стандартною формулою: ІА=(ЗХ–ЛПВЩ)/ЛПВЩ. Вміст інсуліну визначали за допомогою муноферментного аналізу.

Морфологічне морфометричне дослідження проведене у лабораторії фундаментальних досліджень Інституту невідкладної і відновної хірургії ім.. В.К.Гусака АМН України. З видалених тканин виготовляли забарвлені гематоксиліном та еозином препарати за стандартною методикою (Меркулов Г.А.., 1969). При імуногістохімічному забарвленні використовували первинні антитіла проти інсуліну (поліклональні, мурчакові), глюкагону (поліклональні, кролячі) та ядерного антигену клітин, що проліферують, – PCNA (моноклональні, клон PC10). Первинні антитіла виявляли за допомогою системи візуалізації “LSAB 2 for rat” (всі реактиви фірми DAKO, Данія).

Для підтвердження припущень щодо механізму впливу клітинних культур на острівковий апарат ПШЗ було виконано потрійне імунофлюоресцентне фарбування тканини залози у 3 тварин кожної групи на 45 та 70 добу експерименту.. Для цього використовували антитіла проти інсуліну, PCNA, а також DAPI в якості ядерного барвника. Первинн антитіла виявляли за допомогою вторинних із флуоресцентними мітками таким чином, щоб ядра клітин, що діляться, забарвлювались у червоний колір, інших клітин – у синій, цитоплазма інсулін-позитивних клітин – у зелений колір.

Дослідження препаратів здійснювали на мікроскопі Axiostar (Carl Zeiss, Німеччина). Мікрофотографування проводили на дослідницькому мікроскопі Olympus AX70 (Японія) цифровою камерою Olympus DP50, морфометрічне дослідження – з використанням програми AnalySIS Pro 3.2 (фірма SoftImaging, Німеччина).

Морфометричне дослідження стану острівкового апарату проводили на забарвлених муногістохімічно препаратах. Підраховували загальну кількість клітин в острівцях, кількість клітин, в ядрах яких експресується PCNA-антиген (клітини, що знаходяться у процесі поділу), кількість клітин, що містять у цитоплазм нсулін і глюкагон, виміряли розмір кожного острівця. Для вивчення мікроангіопатії було обрано серце. Під час морфометричного дослідження судин серця вимірювали мінімальний внутрішній і зовнішній діаметри певної судини вираховували радіус, абсолютну та відносну товщину стінки судини. Оскільки діаметр вивчених судин коливався від 10 до 150 мкм, то вони було розподілені на три групи: а) дрібні артерії з діаметром від 75 до 150 мкм; б) артеріоли з діаметром від 25 до 75 мкм; в) прекапілярні артеріоли з діаметром менше 25 мкм.

Статистичну обробку проводили за допомогою програми статистичного аналізу Primer of Biostatistics 4.03 (США) і Statistica 6.0 (StatSoft, США). Розбіжності між групами розраховувалися із використанням непараметричного критерію Крускала-Уолліса. Зв'язок між параметрами оцінювали за допомогою коефіцієнту рангової кореляції Спірмена.

Результати досліджень. Після введення алоксану через 30 діб у тварин розвивалася типова картина нсулін-залежного цукрового діабету із підвищенням середнього рівня глюкози до 12,52±2,02 ммоль/л (табл.1), що в 2,9 рази вище в порівнянні з контролем (p<0,05). Ці зміни обумовлені масовою загибеллю клітин, що синтезують нсулін. Так, при морфометричному аналізі ПШЗ було встановлено, що середня кількість острівців на 10 мм2 зрізу зменшилась у 5,3 разів (p<0,05) (табл.2,3), а ті, що залишилися, стали маленькими, в 1,7 рази менше, ніж у нормі (p<0,05), що призвело до зменшення питомого об’єму острівкової тканини в 9,3 разів (p<0,05). У складі острівців, що збереглися, було лише 34,0±2,7% бета-клітин. Це знайшло відображення у зниженні кількості ІСК на одиницю площ в 20 разів (p<0,05). Також встановлено, що деякі ацинарні клітини набули здатність до секреції інсуліну. Такої трансформації найчастіше піддавалися або всі, або більшість клітин у певному ацинусі, тому всі групи мали округлу форму з наявністю невеликого просвіту в центрі, тобто мали морфологію екзокринного ацинуса. Також були виявлені поодинокі інсулін-позитивні клітини серед протокових епітеліоцитів. Результатом зниження кількості клітин, що синтезують нсулін (ІСК), у залозі стало зниження рівня інсуліну крові у 51,5 разів (p<0,05). Але було встановлено прискорення ділення клітин у збережених острівцях в 6,0 разів у порівнянні із нормою (p<0,05). Порушення обміну вуглеводів призводить і до порушень жирового обміну, бо жири стають основним джерелом енергоутворення у багатьох клітинах. Так, спостерігали збільшення рівня ТГ в 2,6 рази (p<0,05) (табл.4), ЗХ – в 1,6 рази (p<0,05), холестерину ЛПНЩ – в 2,1 рази (p<0,05), зниження рівня холестерину ЛПВЩ в 1,8 рази (p<0,05). ІА збільшився в 4,5 разів у порівнянні з інтактними тваринами перевищив критичне значення (5,69±1,36 при нормі не більше 3,0). Дані зміни на 30 добу експериментального ЦД вказують на розвиток на даний термін типово картини діабетичної дисліпідемії. Надмірна глікемія із порушеннями ліпідного обміну є причинами розвитку мікроангіопатії. При гістологічному дослідженн судин серця було виявлено потовщення стінки прекапілярних артеріол, у дрібних артеріях спостерігали ознаки плазматичного просочування. Середня товщина стінки прекапілярних артеріол збільшилась у 1,4 рази (p<0,05) (табл.5), а відносна товщина – у 1,3 рази (p<0,01) (табл.6). Найбільш виразним було потовщення стінок артеріол – абсолютної товщини у 1,6 рази (p<0,001), відносної – у 1,4 рази (p<0,001). Потовщення стінок дрібних артерій було також відчутним абсолютної товщини – у 1,3 рази (p<0,001), відносної – у 1,4 рази (p<0,001).

Надалі (на 45 70 доби експерименту) спостерігали ознаки регенерації острівкової тканини. І хоча кількість острівців на одиницю площі не змінилася, у самих острівцях залишався високим процент клітин, що проліферують (табл.2,3), він був менший ніж на 30 добу, але значно вищий (в 4,3 рази на 45 добу і в 3,1 рази на 70 добу), ніж в інтактних тварин. Але прискорення проліферації клітин не відобразилося на питомому об’ємі острівкової тканини. Істотні зміни відбувалися у клітинному складі острівців. Якщо на 30 добу відносна кількість бета-клітин дорівнювала 34,0±2,7%, то на 45 добу вона вже була на рівні 45,9±3,8% (p<0,05), а на 70 добу – 60,2±3,9% (p<0,05). Тобто в острівцях відбувалося зменшення відсотку альфа-клітин, місце яких займали бета-клітини. Це призвело до зростання середньої кількості ІСК на одиницю площі залози в 1,3 рази (p<0,05) на 45 добу і в 1,9 рази (p<0,05) на 70 добу. Майже у стільки ж разів підвищився і рівень інсуліну в крові на 70 добу – в 2,0 рази. Результатом цього стало зменшення гіперглікемії на 45 добу у 1,1 рази (p<0,001) у порівнянні з 30 добою, та у 1,3 рази (p<0,001) на 70 добу, але цей рівень був набагато більше рівня глюкози у інтактних тварин – в 2,2 рази (p<0,001). При дослідженні показників жирового обміну встановлено достовірне збільшення рівня ТГ (в 2,7 рази, p<0,001), ЗХ (в 1,6 рази, p<0,001) і холестерину ЛПНЩ (в 1,9 рази, p<0,001), зниження рівня ЛПВЩ (в 1,6 рази, p<0,01). ІА був вище в 4,1 разів (p<0,001) ніж в інтактних тварин. Ступінь дисліпідем практично не змінився, достовірної різниці між відповідними показниками не було. Тривала гіперглікемія і дисліпідемія призвели до прогресування мікроангіопатії: спостерігали різке потовщення стінки артерій усіх калібрів, стінки артеріол і дрібних артерій гіалінізовані. Збільшення абсолютно відносної товщини стінки судин різного калібру склало від 1,9 до 2,3 рази у порівнянні із інтактними щурами (для всіх судин p<0,001). При порівнянн даних на 30 і 70 добу наявною є значна прогресія мікроангіопатії – відносна товщина судин достовірно зросла у 1,3-1,4 рази (p<0,01). Таким чином, незважаючи на деяке покращання показників вуглеводного обміну, наявною була прогресія мікроангіопатії.

Таблиця 1

Показники обміну вуглеводів у тварин різних експериментальних груп на 70 добу експерименту

Примітки: 1. Відмінності всіх показників у всіх експериментальних групах із відповідними показниками інтактних тварин достовірні при p<0,001, із показниками тварин, яких вивели з експерименту на 30 добу при p<0,05.

2. Вірогідність відмінностей показників із 1 групою тварин: # – p<0,05, ## – p<0,001.

Таблиця 2

Провідн морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 45 добу експерименту

Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із групою інтактних тварин: † – p<0,05. 2. Вірогідність відмінностей із групою тварин, які були виведені із експерименту на 30 добу: § – p<0,05. 3. Вірогідність відмінностей із 1 групою: * – p<0,05.

Таблиця 3

Провідн морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 70 добу експерименту

Страницы: 1, 2, 3, 4