|
|
Підготовку препаратів і вимір електричних показників проводили за методикою Kosterich J. et al., (1984) з використанням платинових електродів у напрямку перпендикулярному до поздовжньої осі препарату, в умовах його повної імерсії у 0,9%-му розчині NaCl при 370С. З метою стандартизації результатів досліджень поряд з абсолютними значеннями використовували відносні значення показників ПЕВ, які визначали з урахуванням довжини та площі перетину препарату.
Схема остеометричних досліджень складалася з визначення таких показників: маса та довжина стегнової кістки й препарату, максимальний, мінімальний і середній діаметр діафіза та кістковомозкового каналу, середня товщина стінки діафіза. Розраховували також індекси відношення діаметра кістковомозкового каналу до діаметра діафіза й відношення товщини стінки діафіза до його діаметра й діаметра кістковомозкового каналу (Алексєєв В.П.,1966). Всі остеометричні показники визначали за допомогою мікрометра з оптичною системою, який забезпечує точність вимірів ± 0,01мм і припустиму похибку ±0,004 мм.
Демінералізацію препаратів проводили за допомогою повного занурення в 10%-й розчин динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), рН 8,0. Розчин міняли щодня. Контрольні дослідження ПЕВ проводили на 14 28 добу демінералізації. Препарат витягали з розчину ЕДТА, ретельно промивали у 0,9%-му розчині NaCl та залишали на 24 год у свіжоприготовленому розчині. Через добу препарат ще раз промивали 0,9%-м розчином NaCl та визначали показники ПЕВ відповідно до описаної вище методики. Повноту демінералізац контролювали спалюванням препарату в муфельній печі наприкінці експерименту.
Дозовану термічну денатурацію препаратів проводили за допомогою його повного занурення на 30 с у 0,9%-й розчин NaCl , нагрітого до 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 або 1000С ±0,50С. Всі виміри проводили через 25 с після забирання препарату з нагрітого розчину при 370 С.
Напруження кисню в литковому м'язі щурів вимірювали in situ полярографічним методом з використанням відкритого платинового електрода на полярографі LP7 (Прага) (Березовський В.А.,1975). Споживання кисню в окремих фрагментах стегнової кістки визначали за допомогою платинового електрода за методикою Shirrmacher K. et al.,(1997). Спонгіозну частину кісткових фрагментів відмивали у 0,9%-му розчині NaCl при 25-280С і рН 7,4. Маса кісткових фрагментів становила від 70 до 100 мг, товщина - 130-500 мкм. Фрагменти стегнової кістки поміщали в циліндричну термостатовану комірку об'ємом 2мл3, яка була заповнена фізіологічним розчином, при 370С и рН 7,4. Хроноамперограму реєстрували протягом 30 хв при швидкості руху діаграмної стрічки 10 мм/с. Споживання кисню за хвилину розраховували за кривою спаду кисню в часі на 100 г тканини. Коефіцієнт розчинності кисню приймали рівним 0,024 мл·мл-1·атм-1 при 370С.
Дослідження вмісту в кістці мінеральних, органічних речовин води проводили гравіметричним методом при 20-220С і відносній вологості 75-80%. На 1-му етапі за допомогою ''ТВ-500'' визначали масу вологого препарату з точністю ±1 мг. На 2-му етапі препарат висушували в сушильній шаф при 1050С до стабільної маси та визначали його “суху масу”. На 3-му етапі препарат спалювали в муфельній печі при 7000С не менше ніж 5 год і визначали його “озолену масу”. Кількість води в препараті розраховували як різницю між масою вологого й сухого препарату, органічних речовин - як різницю між масою сухого й озоленого препарату. Кількість мінеральних речовин прирівнювали до вмісту золи. Щільність вологого та сухого препаратів кістки розраховували за допомогою розподілу його маси на об'єм.
Статистичний аналіз результатів проводили з використанням пакета програмного забезпечення “Statistica” 6.0 і Microsoft Exel 2000. Вірогідність різниці середніх величин визначали за t - критерієм Стьюдента і U - критерієм Манна - Уітні. Значення р<0,05 вважали вірогідними.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Потенціал навантаження стегнової кістки щурів при різних ступенях механічних впливів. При дії на стегнову кістку стандартного навантаження (Н), яке становило 50% від маси тіла щура, реєструвалися характерні двофазні коливання електричного потенціалу, амплітуда (А) яких сягала 1200 мкВ, а тривалість - 0,5 с.
Перша фаза ПН мала позитивне початкове відхилення й виникала у відповідь на додаток механічного навантаження. Друга фаза виникала при усуненні навантаження. Її початкове відхилення мало зворотну спрямованість, а амплітуда дорівнювала або була близька до амплітуди першої фази. Значення електричного потенціалу (мкВ), що доводиться на одиницю навантаження (г) – (А/Н), перебувала в діапазоні від 1 до 3 мкВ/г. При східчастому збільшенні навантаження від 30 до 100% маси тіла щура амплітуда ПН зростала в експонентній залежності.
У щурів, що перебували в умовах 28-добової жорсткої гіпокінезії, амплітуда ПН стегново кістки при навантаженнях I, II і III ступеня була на 37, 35 і 23% відповідно менше, ніж у тварин контрольної групи.
Середня амплітуда ПН у контрольних щурів становила 720,0±89,5, 1102,6±10,8 і 1537,6±189,6 мкВ, а у дослідних - 456,8±54,5, 812,8±83,6 і 1287,7± 173,1 мкВ відповідно при навантаженнях I, II і III ступеня. При навантаженнях I і II ступеня розходження в амплітуді ПН між тваринами контрольної та дослідної груп були статистично вірогідними (p<0,05).
Загальна закономірність збільшення амплітуди ПН при збільшенні ступеня навантаження на стегнову кістку була характерна як для контрольних, так і для дослідних щурів. Однак у тварин, які перебували в умовах гіпокінезії, значення приросту амплітуди ПН були завжди менше, ніж у контрольних. Як у контрольних, так і у дослідних щурів значення електричного потенціалу, що доводиться на одиницю навантаження, при впливах I і II ступеня збільшувалися, а III ступеня - зменшувалися. Однак середні значення А/Н у дослідних тварин при навантаженнях I II ступеня були на 36% менше, ніж у контрольних. При навантаженнях III ступеня вірогідних розходжень в амплітуді ПН і значенні А/Н між контрольними та дослідними тваринами не встановлено.
Дослідження впливу вікових змін кісткової тканини на ПН стегнових кісток проводили на щурах віком 2 , 6 і 24 міс. Загальна тенденція до збільшення амплітуди ПН з збільшенням навантаження на кістку була властива для тварин усіх вікових груп.
Зростаючи в експонентній залежності, ПН сягав максимальних значень при навантаженнях III ступеня. При всіх ступенях навантаження максимальні амплітуди ПН були зареєстровані у стегнових кістках 6-місячних щурів. У 2-місячних щурів ПН не перевищував 9,1-10,3-11,6% амплітуди ПН 6-місячних тварин при відповідних ступенях навантаження. У 24-місячних тварин ПН був лише 54,5-78,7-81,4% такого показника 6-місячних щурів при відповідних ступенях навантаження. Слід зазначити, що найбільші розходження амплітуди ПН у 2, 6 і 24-місячних щурів були зафіксован при навантаженнях I та II ступеня.
Незалежно від віку щурів, при збільшенні навантажень від 30 до 50% від маси тіла значення електричного потенціалу, що доводиться на одиницю навантаження, збільшувалися, а при навантаженнях, які сягали 100% від маси тіла - знижувалися.
Максимальне значення цього показника було зареєстровано в 6-місячних щурів і сягало 6,3-7,8 мкВ/г. У 2-місячних щурів він не перевищував 0,8-0,9 мкВ/г, а у щурів 24-місячного віку він зменшувався до 2,8-4,2 мкВ/г.
Пасивні електричні властивості компактної кістки білих щурів при стереотипному функціональному навантаженні. При мультичастотному мпедансометричному тестуванні електрична ємність препаратів стегнової кістки контрольних щурів змінювалася згідно з експонентною залежністю, досягаючи мінімуму на частоті 1 МГц.
Максимальне значення реактивного опору реєстрували на частот 10 кГц. Воно суттєво зменшувалося як на більш високих, так і на більш низьких частотах. Оскільки реактивний опір відображає стан поляризаційних процесів у біологічних тканинах, можна говорити про те, що на частоті 104 Гц вони сягали максимального ступеня виразності. Властивості частотної динаміки мпедансу й активного опору були дуже близькі. На частотах 104,105 Гц їх значення суттєво не змінювалися, на частотах 102,103 Гц вони зростали, а на частоті 106 Гц – зменшувалися.
Для встановлення зв'язку вікових змін структури та складу кістки з її ПЕВ були проведен дослідження на 49 щурах-самцях віком від 1 до 24 міс. Для стегнової кістки одномісячних щурів були характерні низькі значення імпедансу, активного та реактивного опору і високі показники ємності.
Із віком тварини імпеданс, активний і реактивний опір збільшувалися, а ємність зменшувалася. Найбільш значні зміни ПЕВ відзначалися протягом перших 3-4-х місяців життя. У дорослих щурів показники ПЕВ залишалися відносно сталими, а після 18 міс значення імпедансу, активного й реактивного опору починали поступово зменшуватися, а ємності - збільшуватися.
Маса стегнових кісток збільшувалася втричі протягом перших 3-х місяців життя, від 6 до 12 міс - сягала пікових значень, а після 18 міс починала зменшуватися, що свідчило про початок вікової інволюції кісткової тканини. Остеометричні дослідження показали, що діаметр кістковомозкового каналу в період активного росту щурів (1-6 міс) збільшувався істотніше. У тварин віком від 6 до 14 міс його показники залишалися відносно стабільними, а після 14 міс він знову починав збільшуватися. Товщина стінки діафіза в перші 3-4 міс життя щурів також зростала більше ніж удвічі. Потім темпи його приросту істотно сповільнювалися та зберігалися такими до 12-місячного віку. У щурів після 18 міс життя товщина стінки діафіза починала поступово зменшуватись. Аналіз закономірностей віково динаміки остеометричних показників стегнових кісток щурів дозволив виділити найбільш характерні періоди їх змін. Вони відповідали віку 1-3, 6-14, 18-24 міс практично повністю збігалися з описаними вище періодами вікових змін ПЕВ кістки. Дослідження вікової динаміки основних складових кісткового матриксу показало, що вміст мінеральних речовин істотно збільшувався у перші 3-4 міс життя щура (з 45,5±1,1 до 56,6±1,6%). Із віком мінералізація кістки продовжувала збільшуватися, але значно меншими темпами. У щурів віком від 12 до 18 міс масова частка мінеральних речовин залишалася стабільно високою (60,4±0,2%), а після 18 міс почала відзначатися чітко виражена тенденція до її зниження. У 24-місячних тварин масова частка мінеральних речовин у складі кісткового матриксу не перевищувала 53,7±1,3%. Вікова динаміка вмісту органічних речовин наближалася до динаміки вмісту мінеральних речовин. У одномісячних щурів масова частка води у кістковій тканині сягала 35,0±1,4%, у щурів 6-місячного віку вона зменшувалася до 17,0±0,3%. У тварин, вік яких перевищував 18 міс, вміст води в кістковій тканині починав поступово збільшуватися й до 24-місячного віку сягав 26,39±1,35%. Щільність кістки також найбільше зростала в перші 3 міс життя щурів. До 18 міс вона залишалася стабільною, а потім починала поступово зменшуватися.
Кореляційний аналіз показав, що між віковими змінами показників гідратації та мінералізації компактної кістки щурів існувала значна зворотна залежність (r=-0,894; р<0,01). Показники вмісту органічних і мінеральних речовин також були пов'язані зворотною кореляційною залежністю, однак ступінь виразності був значно меншим (r=-0,406; p<0,05). Аналіз кореляційних зв'язків показників ПЕВ і складу кістки показав наявність вірогідного прямого зв'язку між ємністю, вмістом води й органічних речовин (r=+0,858; r=+0,485) та імпедансом, активним реактивним опором і вмістом мінеральних речовин (r=+0,766; r=+0,765; r=+0,893). Вірогідний зворотний кореляційний зв'язок був виявлений між ємністю і вмістом мінеральних речовин (r=-0,877), а також між імпедансом, активним, реактивним опором і вмістом води (r=-0,594; r=-0,592; r=-0,901) та органічних речовин (r= -0,491; r=-0,392; r=-0,304). Отримані результати свідчать про те, що вікові розходження пасивних електричних властивостей стегнової кістки щурів визначаються особливостями її складу та структури в різні періоди життєвого циклу.
Пасивні електричн властивості кістки при дозованій гіпокінезії. Після 28-добової жорсткої гіпокінезії у 67% дослідних тварин спостерігалися характерні ознаки остеопенії – низька маса й щільність кістки в порівнянні з тваринами контрольної групи. В 33% щурів ці показники не відрізнялися від контролю. Отримані результати свідчили про наявність міжіндивідуально варіабельності та відносної "інертності" реакції компактної кістки щурів на зменшення функціонального навантаження, що узгоджується з даними інших дослідників. У кістках тварин, що мали ознаки остеопенії, відзначалося вірогідне зменшення об'ємної маси мінеральних речовин (на 15,6%) та збільшення вмісту води (на 10,6%). Порівняльний аналіз показав, що у контрольних тварин щільність сухої кістки сягала 1,95±0,09 мг/мм3, а у тварин, що мали ознаки остеопенії - не перевищувала 1,65±0,13 мг/мм3 (р<0,05). Зменшення функціонального навантаження на кінцівки в умовах жорсткого 28-добового обмеження рухливості істотно не впливало на ріст стегнової кістки в довжину, але помітно знижувало темпи її аппозиційного росту, що призводило до зменшення маси стегнової кістки, середнього діаметра діафіза та просвіту кістковомозкового каналу на 16,6, 19,0 і 20,4% відповідно (p<0,05).
Для ПЕВ препаратів стегнових кісток, що мали ознаки остеопенії, на всьому діапазоні частот були властиві низькі величини електричного імпедансу, активного й реактивного опору високі показники електричної ємності. Так, на частоті 104 Гц зменшення середньої величини електричного імпедансу сягало 50,1%, реактивного й активного опорів - 80,4 і 50,2% відповідно при збільшенні електричної ємност на 396,0%.
При збільшенн тривалості гіпокінезії до 45 діб у всіх дослідних щурів спостерігалися ознаки остеопенії. Маса стегнової кістки тварин була вірогідно меншою, ніж контролю (750,01±65,01 і 894,55±30,61 мг відповідно), а щільність кісткової тканини не перевищувала 1,62±0,04 мг/мм3 (р<0,05). Вміст мінеральних і органічних речовин у компактній кістц дослідних щурів вірогідно зменшувався, а вміст води - збільшувався. Якщо в контрольній групі щурів мінеральна насиченість кісткової тканини становила 1,46±0,03 мг/мм3, то у тварин дослідної групи вона не перевищувала 1,23±0,04 мг/мм3 (p<0,001). У щурів, що перебували в умовах 45-добової гіпокінезії, відзначалася більш висока гідратація кісткової тканини порівняно зі щурами контрольної групи порівняно з тваринами, які знаходилися в умовах жорсткої 28-добової гіпокінез (0,43±0,01, 0,73±0,05 0,52±0,03 мг/мм3 відповідно). Характер і загальна спрямованість змін діаметра діафіза та кістковомозкового каналу стегнових кісток щурів після жорстко 45-добової гіпокінезії був таким, як і у тварин після жорсткої 28-добово гіпокінезії, проте ступінь їх виразності був найбільшим, що призводило до вірогідного зменшення товщини стінки діафіза на 22,2% (р<0,05).
Гіпокінетичні порушення складу й остеометричних параметрів стегнової кістки дослідних щурів супроводжувалися характерними змінами її ПЕВ. На рис.10 представлена динаміка ємності, імпедансу, активного та реактивного опору препаратів стегнової кістки тварин контрольної й дослідно груп при проведенні мультичаcтотного імпедансометричного тестування.
Загальна спрямованість змін ПЕВ препаратів тварин після 45-добової гіпокінезії на всьому діапазоні частот була такою самою, як у тварин після 28-добової гіпокінезії, однак ступінь їх виразності був значно більшим. На частоті 104 Гц питома ємність і реактивний опір становили 773,8 і 17,1% відповідно щодо контролю. Вірогідно, хоча не так значно, зменшувалися імпеданс і активний опір (до 26,6 і 26,4% відповідно щодо контролю).
