Реферат: Властивості кальційактивованих та АТФ–індукованих калієвих струмів мембрани міоцитів taenia caeci морської свинки

Локальне підвищення Са2+ виступає важливою ланкою в регуляції мембранного потенціалу, збудливості клітини та агоністіндукованих реакцій (Gordienko et al. 1998, Collier et al. 2000). Ці процеси є безпосереднім результатом вивільнення онів Са2+ через ріанодинчутливі канали, або через ІР3 активовані канали на саркоплазматичному ретикулумі. В деяких клітинах, локальне вивільнення Са2+ може призводити до утворення так званої Са2+ хвилі, що може розповсюджуватись навколо місця ініціації та через всю клітину (Gordienko et al. 1998, Jaggar et al. 2000). Локальне вивільнення Са2+ в безпосередній близькості до плазматичної мембрани, викликає просторово обмежене збільшення концентрації останнього, що сягає 1 мкМ (Perez et al. 1999). Таке локальне підвищення [Са2+]i активує Са2+залежн онні канали, що розташовані поблизу місця вивільнення іонів Са2+. Тому головним зв’язуючим ланцюгом між вивільненням Са2+ та клітинною відповіддю, виступає активація іонної провідності в плазматичній мембрані.

Активація вихідного калієвого струму відповідає за генерацію неадренергічних нехолінергічних гальмівних синаптичних потенціалів (НАНХ ГСП). На сьогоднішній день загальноприйнята думка, що АТФ, так само як і NO, виступає медіатором гальмівної нейропередачі в ШКТ (Шуба та ін. 1998, Shuba et al.2003, Moore et al. 1990). В taenia cаесi морської свинки стимуляція НАНХ-нейронів призводила до генерації двофазного ГСП (И.А. Владимирова та ін. 1984,1993). Повільний компонент цього ГСП блокується інгібіторами NO-синтази та харибдотоксином, блокатором BК каналів (Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003, Загороднюк та ін. 1994), а швидкий – антагоністом пуринорецепторів суруміном, та блокатором SК каналів апаміном (Владимирова та ін. 1986, Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003). Проведені нами досліди по вивченню впливу АТФ на поодинокі ГМК taenia cаесi морської свинки показали, що АТФ (100 мкМ) при підтримуваному потенціалі в –40 мВ, призводив до значного приросту СВС малої амплітуди. При цьому частота СВС великої амплітуди сильно не змінювалась. Як було вказано раніше, СВС мало амплітуди формуються здебільшого за рахунок активації SК каналів. Прикладення d-TK, як блокатора SК каналів, призводило до значного пригнічення СВС мало амплітуди, та усунення впливу АТФ. Це збігається з існуючими даними на багатоклітинних препаратах, уявленнями та літературними даними (Bayguinov et al. 2000, Shuba et al. 2003). Для встановлення джерела кальцію, що задіється в цих процесах було використано мембраннопроникний антагоніст ІР3 рецепторів – 2-аміноетоксидифеніл борат (2-АРВ) (Maruyama et al. 1997). Преінкубація клітин в розчині з 2-АРВ (30 мкМ) не призводила до суттєвих змін СВС, активованих вивільненням Са2+ з ріанодинових депо. В той же час ефект збільшення частоти СВС при аплікації АТФ був відсутній. Дослідження, проведені на багатоклітинних препаратах показували, що 2-АРВ пригнічував ГСП, викликані інтрамуральним подразненням у препаратах caecum та colon, а також АТФ та НА – викликану гіперполяризацію (Shuba et al. 2003). Це дає можливість зробити висновок, що вивільнення Са2+ з ІР3чутливого кальцієвого депо виступає проміжною ланкою в передачі між P2Y рецепторами активуванням КСа каналів малої провідності, які приймають участь у генерації апамінчутливого ГСП.

АТФ, як гальмівний нейромедіатор, взаємодіє у гладеньких м’язах з P2Y рецепторами, котрі відносяться до групи метаботропних рецепторів. Ці рецептори зв’язані з внутрішньоклітинними G-білками (Gq/11) завдяки яким активують фосфоліпазу С (Kьgelgen et al. 2006). Для визначення ролі фосфоліпази С у генерації АТФ-індукованої відповіді, було використано інгібітор фосфоліпази С U73122 (Smith et al. 1990). За таких умов, додавання АТФ на фоні U73122 (5 мкМ) не призводило до зміни частоти появи СВС, як великої так і малої амплітуди. На багатоклітинних гладеньком’язових препаратах caecum (Shuba et al. 2003), застосування U73122, призводило до зменшення амплітуди ГСП, викликаного нтрамуральним подразненням, у порівнянні з тестовим майже на 50%. Наступне додавання апаміну, блокатора КСа малої провідності, призводило до повного блокування ГСП, та появи нехолінергічних збуджуючих синаптичних потенціалів.

Наведені дан дозволяють припустити, що пуринергічна активація СВС є результатом локального вивільнення іонів Са2+ із саркоплазматичного ретикулуму, внаслідок активації P2Y рецепторами фосфоліпази С та задіяного нею інозитолтрифосфатного механізму.

ВИСНОВКИ

1.         За допомогою метода фіксації потенціалу було показано, що вихідний трансмембранний онний струм ГМК taenia caeci морської свинки має три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти Са2+залежного К+ струму.

2.          Вихідний калієвий струм на 50% блокується неселективним блокатором ВК каналів ТЕА (1мМ), та на 40% − селективним блокатором ВК каналів паксиліном (100 нМ).

3.         Близько 10% вихідного калієвого струму пригнічується блокатором нікотинових холінорецепторів та КCa каналів d-ТК в концентрації 50 мкМ.

4.         Спонтанн вихідні струми (СВС) за своїми ознаками можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС великої амплітуди чутливі до паксиліну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплітуди чутливі до дії d-ТК, що свідчить про активацію SК каналів.

5.         Блокатор ІР3 рецепторів 2-АРВ (30 мкМ) пригнічує частоту СВС малої амплітуди та не впливає на СВС великої амплітуди. Це свідчить, що результатом виникнення СВС малої амплітуди є вивільнення Са2+ з ІР3чутливого Са2+ депо міоцитів.

6.         Активація пуринорецепторів шляхом прикладення АТФ (100 мкM) супроводжується значним приростом частоти СВС малої амплітуди, що обумовлено активацією SК каналів чутливих до дії d-TK.

7.         АТФ в присутності селективного блокатора фосфоліпази С U73122 (5 мкМ) не впливає на частоту та амплітуду СВС

8.         АТФ-індукований Са2+ залежний калієвий струм в міоцитах taenia caeci обумовлений залежним від фосфоліпази С збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР3, та наступним вивільненням Са2+ з ІР3 чутливого депо міоцитів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1.         Nessin V.V. Purenergic activation of the cationic conductivity in the guinea pig // Нейрофізіологія/Neurophysiology – 2003. – T.35, № 3/4, – C. 361.

2.         Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. d-тубокураринчутливий компонент кальційзалежного калієвого струму в міоцитах taenia coli морської свинки // Нейрофізіологія/Neurophysiology – 2005. – Т.37, № 3, – С. 271-276. (Всі електрофізіологічні дослідження, обробка експериментального матеріалу та написання статті виконано особисто автором).

3.         Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. Характеристики паксилінчутливого кальційзалежного калієвого струму ізольованих міоцитів кишечнику, Нейрофізіологія/Neurophysiology – 2007. – Т.39, № 3, – С. 201-207. (Вс електрофізіологічні дослідження, обробка експериментального матеріалу та написання статті виконано особисто автором).

4.         Кришталь Д.О., Несін В.В., Шуба М.Ф. Модуляція калієвого струму А-типу в гладеньком’язових клітинах vas deferens щура кальцій/кальмодулінзалежною протеїнкіназою ІІ // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2007. – Т.39, № 4/5, – С. 419-422. (Приймав участь у обробц експериментального матеріалу, узагальненні та обговоренні результатів досліджень).

5.         Кришталь Д.О., Несін В.В., Шуба М.Ф. Дія паксиліну на кальційзалежний калієвий струм в ізольованих гладеньком’язових клітинах сім’явивідних протоків щура // Фізіологічний журнал. 2007. – Т. 53, № 5, - С. 67-74. (Автор приймав участь у обробц експериментального матеріалу та написанні статті).

Тези доповідей

1.         Nessin V.V. Purenergic activation of the spontaneous transient outward current in the guinea pig taenia coli // Abstract book of IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptor, Channels, Messengers”, Yalta, September 16-28, 2004.

2.         Несін В.В. Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією міоцитів кишечнику морської свинки // Матеріали міжнародної конференц Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, приурочено до 80-ліття з дня народження проф. І.В.Шостакової. – С. 55. Львів, 7–9 жовтня 2004.

3.         Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. Властивості катіонного струму активованого АТФ у міоцитах кишечнику морської свинки // Матеріали І Української наукової конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики ” – С. 124. Харків, 20-22 вересня 2004.

4.         Несін В.В. Вплив d-тубокурарину на кальційзалежний калієвий струм в ізольованих гладеньком’язових клітинах кишечнику // Матеріали міжнародної науково конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, приуроченої до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету ім. Івана Франка. – С. 107. Львів, 8-11 листопада 2006.

5.         Несін В.В. Властивості паксилінчутливої компоненти кальційзалежного калієвого струму зольованих гладеньком’язових клітинах кишечнику // Матеріали 4-го з’їзду Українського біофізичного товариства – С. 79. Донецьк, 19-21 грудня 2006.

АНОТАЦІЇ

Несін В.В. Властивості кальційактивованих та АТФ-індукованих калієвих струмів мембрани міоцитів taenia caeci морської свинки. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2007

З використанням методу фіксації потенціалу було проведено розділення трансмембранних вихідних калієвих струмів. Показано, що вихідний калієвий струм на 50% блокувався неселективним блокатором К+ каналів ТЕА (1мМ), та на 40 % селективним блокатором ВК каналів паксиліном (100нМ). Близько 10% вихідного калієвого струму пригнічується блокатором нікотинових холінорецепторів та SК каналів – d-тубокурарином (d-TK) в концентрації 50 мкМ. Вивчення впливу наведених блокаторів на спонтанні вихідні струми (СВС) показало, що останні за своїми ознаками можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС великої амплітуди чутливі до паксиліну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплітуди чутливі до дії d- TK. Це свідчить пор те, що вони переносяться через SК канали.

Дослідження СВС під час прикладання АТФ показало, що основна роль в пуринергічному гальмуванні, належить SК каналам, як основному механізму гіперполяризації мембрани ГМК. Дослідження внутрішньоклітинних шляхів гальмування, викликаного активацією пуринорецепторів мембрани ГМК показало, що блокатор ІР3 рецепторів 2-АРВ (30мкМ) пригнічував частоту СВС малої амплітуди та не впливав на СВС великої амплітуди. Це свідчить, що результатом виникнення СВС малої амплітуди вивільнення Са2+ з ІР3-чутливого Са2+ депо міоцитів. Додаткова аплікація АТФ (100 мкМ) як на фоні 2-АРВ, так і блокатора фосфоліпази С - U73122 не призводила до зростання частоти та амплітуди СВС.

Таким чином можна сказати, що АТФ−індуковані СВС в міоцитах taenia caeci обумовлен вивільненням Са2+ з ІР3 чутливого депо, шляхом залежним від фосфоліпази С збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР3.

Ключові слова: гладеньком’язов клітини, taenia caeci, АТФ, СВС, d-тубокурарин.

Несин В.В. Свойства кальцийактивированих и АТФ-индуцированых калиевых токов мембраны миоцитов taenia caeci морской свинки. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 биофизика. – Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2007.

Работа посвящена фармако-биофизическому изучению компонентов суммарного трансмембранного ионного тока миоцитов taenia cаесi морской свинки и выяснению клеточных механизмов действия АТФ как медиатора торможения ЖКТ морской свинки. С помощью метода фиксации потенциала было проведено разделение трансмембранных выходящих калиевых токов. Показано, что выходящий калиевый ток на 50% блокируется неселективным блокатором К+ каналов ТЕА (1мМ), и на 40% − селективным блокатором ВК каналов паксилином (100нМ). Для снятия неоднозначности, связанной с действием апамина (активация неселективного катионного тока) в наших опытах в качестве блокатора SК каналов был применен d-TK, которий является широко известным блокатором никотинных холинорецепторов. Около 10% выходящего калиевого тока угнетается блокатором никотиновых холинорецепторов и SК каналов - d-тубокурарином (d-TK) в концентрации 50мкМ. Изучено влияние этих блокаторов на спонтанные выходящие токи (СВТ). Показано, что последние по своим характеристикам могут быть разделены на токи малой и большой амплитуды. СВТ большой амплитуды чувствительны к действию паксилина и ТЕА, и переносятся через ВК каналы. СВТ малой амплитуды чувствительны к d-TK и переносятся через SК каналы.

Изучение АТФ−вызванных СВТ показало, что основная роль в пуринергическом ответе принадлежит SК каналам. Активация пуринорецепторов приложением АТФ (100мкМ) при −40мВ сопровождается значительным приростом частоты СВТ малой амплитуды 60±5% (n=4). Использование d-TK, в качестве блокатора SК каналов, приводило к угнетению СВТ малой амплитуды, и устранению эффекта действия АТФ. Исследование клеточных путей торможения, вызванного активацией пуринорецепторов мембраны миоцитов, показало, что блокатор ІР3 рецепторов 2-АРВ (30мкМ) уменьшал частоту СВТ малой амплитуды и не влиял на СВТ большой амплитуды. Это свидетельствует о том, что результатом возникновения СВТ малой амплитуды является освобождение Са2+ из ІР3 чувствительного Са2+ депо миоцитов. Приложение АТФ на фоне 2-АРВ (преинкубация 10 мин) не сопровождалось увеличением частоты СВТ. Для изучения роли фосфолипазы С в АТФ−индуцированных ответах, был использован ингибитор фосфолипазы С - U73122. На фоне U73122 аппликация АТФ не приводила к увеличению частоты и амплитуды СВТ. Таким образом, можно сказать, что АТФ−вызванные СВТ в миоцитах taenia caeci обусловлены освобождением Са2+ через ІР3чувствительние рецепторы саркоплазматического ретикулума вследствие зависимого от фосфолипазы С увеличения уровня внутриклеточного ІР3.

Ключевые слова: гладкомышечные клетки, taenia caeci, АТФ, СВТ, d-тубокурарин.

Nesin V.V. The properties of Ca2+-activated and ATP-induced potassium currents of smooth muscle cell membrane of guinea-pig taenia caeci. – the Manuscript.

Thesis for a candidate`s degree by speciality 03.00.02 – biophysics. – Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

The dissertation is devoted to pharmacological and biophysical investigations of the components of outward transmembrane ionic current in single smooth muscle cells isolated from guinea-pig taenia caeci and clarifying the mechanisms of the action of ATP as an inhibitory neurotransmitter in guinea-pig gastrointestinal tract. Different components of the net outward current were separated using patch-clamp technique. It was shown that outward potassium current was inhibited at 50 % by application of 1 mM of non-selective potassium channels blocker TEA and at 40 % - by application of 100 nM of high-specific BK channels blocker paxilline. About 10 % of the net outward current was suppressed by application of 50 мM of SK channels and nicotinic cholinergic receptors d-tubocurarine (d-TK). Effects of these blockers on the spontaneous transient outward currents (STOCs) were also studied. It was shown that STOCs could be divided on two groups depending on its characteristics. Large STOCs are sensitive to the blocking action of TEA and paxilline and thereby are likely to determined by BK channels activity. Mini STOCs are sensitive to d-TK which is an evidence for involving of SK channels.

The studying of STOCs during application of ATP revealed that the main role in purinoergic inhibition is devoted to SK channels as a mainstream mechanism of SMC membrane hyperpolarization. The investigation of the intracellular pathways of inhibition induced by an activation of SMC purinoergic receptors testified that a blocker of IP3 receptor 2-APB (30 мM) decreased frequency mini STOCs and did not alter large STOCs. In result , we can assume that origin of small amplitude STOCs is due to calcium  release from sarcoplasmic reticulum of SMC through IP3 receptors. The additional application of ATP(100 мM) along with 2-APB as well as with U73122 (blocker of phospholipase C) did not invoke increase in frequency and amplitude of STOCs.

Thus, ATP induced STOCs in SMC of taenia caeci are generated due to enhancement of  flux of calcium caused by activation of PLC and, consequently, increasing production of IP3 which, in turn, leads to activation of IP3 sensitive receptors of sarcoplasmic reticulum membrane.

Keywords: smooth muscle cells, taenia caeci, ATP, STOCs, d-tubocurarine.