Реферат: Властивості кальційактивованих та АТФ–індукованих калієвих струмів мембрани міоцитів taenia caeci морської свинки
В наступних дослідах для розділення вихідного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналів - паксилін (100нМ) (Gungdi et al. 1999). Додавання до зовнішнього розчину паксиліну викликало значне пригнічення вихідного струму (рис 6.А), та суттєво зменшувались осциляції. Додаткове додавання d-TK на фоні паксиліну викликало додатково незначне пригнічення вихідного струму. На рис 6. Б наведено дію d-ТК на вихідний струм. Як і в попередньому разі, d-ТК заблокував незначну частину вихідного струму, до того ж осциляції струму та його кінетика майже не змінилась. Додавання паксиліну до розчину в присутності d-ТК, призводило до значного пригнічення вихідного струму, при цьому значно зменшувались осциляц струму та його кінетика. Отриманні дані дозволяють зробити припущення, що паксилін та d-ТК діють на різні типи каналів незалежно один від одного. До того ж слід відмітити, що вклад паксилінчутливих каналів до загального вихідного струму значно більший, ніж вклад d-тубокураринчутливих каналів.
Властивост спонтанних вихідних струмів гладеньком’язових клітин. Друга частина роботи була присвячена вивченню характеристик спонтанних вихідних струмів (СВС), та впливу на них блокаторів калієвих каналів. В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу виникали СВС, реєстрація яких проводилась протягом 100 с. СВС починали з’являтись при потенціалах більш позитивних ніж − 60 мВ (рис. 7). Як видно з рисунка, зі збільшенням мембранного потенціалу зростали амплітуда та частота зареєстрованих СВС.
СВС різно амплітуди можуть утворюватись за рахунок багаторазового локального звільнення Са2+ з внутрішньоклітинного депо, а також неоднорідності популяц кальційактивованих калієвих каналів. Як встановлено, в утворенні СВС приймають участь як ВК канали, так і SК канали. Окрім цього, в деяких роботах (Kong et al. 2000) припускають, що СВС малої амплітуди в більшості формуються за рахунок активації SК, в той час як СВС великої амплітуди − за рахунок активац ВК.
Дія блокаторів КСа каналів, d-ТК та ТЕА, на СВС (підтримуваний потенціал – 30 мВ) наведено на рис. 8. Аплікація d-ТК, як блокатора SК каналів, призводила до пригнічення СВС мало амплітуди, в той час як частота появи СВС великої амплітуди майже не зменшувалась. Додавання ТЕА (1мМ) як блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК призводило до пригнічення не тільки СВС великої амплітуди, але і залишкових СВС малої амплітуди. На рисунку 8.Б подано амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС мембрани ГМК. Ймовірно, що СВС великої амплітуди мають в своєму складі d-ТК чутливий компонент, що переноситься через SК канали. В той же час в формуванні СВС малої амплітуди приймає участь ТЕАчутливий компонент.
Ці дослідження показали, що СВС в ГМК taenia cаесі морської свинки є результатом відкривання ВК каналів, чутливих до дії паксиліну та ТЕА, та SК каналів, чутливих до д d-TK.
Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією ГМК кишечнику морської свинки. Активація пуринорецепторів мембрани нтестинальних ГМК аплікацією АТФ, доданого до зовнішнього розчину, активує КCa канали. Ми вивчали ефекти наведеного агоніста на струм при підтримуваному потенціалі − 40 мВ.
За таких умов АТФ в концентрації 100 мкM істотно підвищував частоту появи СВС, а особливо компоненти малої амплітуди. Приріст СВС малої амплітуди на максимумі складав 60% ±5% (n=4) (рис. 9).
У більшості ГМК локальне спонтанне вивільнення кальцію (спарки) обумовлено активністю ріанодинових депо, оскільки аплікація ріанодину викликає блокування спонтанного та підсиленого агоністами вивільнення іонів Са2+ (Guerrero-Hernandez et al. 2002). З іншого боку показано, що виділення кальцію з інозитолтрифосфат (ІР3) - керованого депо є як джерелом активності Са2+ puffs” в гладеньких м`язах, так і регенеративної взаємодії між виділенням кальцію з ІР3 рецепторів та ріанодинових рецепторів (Boittin et al., 2000). Зазвичай, підсилення продукції ІР3 та наступне виділення Са2+ характерною рисою для відповіді на аплікацію гальмуючих агоністів в гладеньких м`язах. У випадку гладеньких м`язів ШКТ, цей механізм може пояснити пригнічувальну дію АТФ, який вважається гальмівним нейротрансміттером, виділеним з ентеро-мотонейронів (Shuba et al. 2003).
Преінкубація клітин в розчині, що містив 30 мкМ 2-АРВ, блокатора ІР3 рецепторів, протягом 10 хвилин показала, що прикладення АТФ (100 мкМ) не призводить до суттєвих змін у частоті появи викликаних СВС, як малої так і великої амплітуди (рис. 10). Окрім цього, інкубація в розчині 2-АРВ призводить до незначного зменшення частоти СВС малої амплітуди (дані не наведено), що може свідчити про залежність цієї частини СВС від кальцію, що звільняється з ІР3 чутливого депо. До того ж можна припустити, що активація ІР3 залежного депо виступає пусковим механізмом в ефекті активації гальмування, викликаного АТФ.
Для блокування ІР3 шляху застосовували блокатор фосфоліпази С (U73122). За таких умов не відбувалось збільшення частоти СВС при аплікації АТФ. (Рис. 11). Відсутність збільшення частоти СВС у відповідь на аплікацію АТФ на фоні U73122 до зовнішнього розчину свідчить, що ІР3 залежне збільшення вивільнення кальцію − основний механізм P2Y рецептор-модульованої стимуляц вихідного струму та гіперполяризації. Вивільнення кальцію асоційоване з активацією SK та BK каналів міоцитів taenia caeci.
На рис. 12 подано вплив блокаторів КСа каналів на викликані агоністіндукованою активацією СВС. Потенціал фіксації становив – 40 мВ. Як видно d-ТК, як антагоніст SK каналів, в концентрації 50 мкМ послаблював СВС малої амплітуди (Рис. 12). СВС записано протягом 100 сек. реєстрації (n= 5). СВС велико амплітуди були також дещо пригнічені застосуванням d-ТК. Це вказує на наявність в складі викликаних СВС великої амплітуди компоненти струму d-ТКчутливих каналів. Результати свідчать, що СВС у ГМК taenia caeci морської свинки, результатом відкривань BK каналів та d-ТКчутливих каналів. Аплікація ТЕА (1 мМ), як неселективного блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК блокувала не лише СВС великої амплітуди, але і залишкові СВС малої амплітуди. На рис. 12 Б. наведено амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС, індукован аплікацією АТФ. Пригнічення SK каналів може призводити до редукції СВС велико амплітуди та сприйняття останніх в якості СВС малої амплітуди після застосування d-ТК.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
В результат проведених досліджень по розділенню сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього м’яза сліпої кишки (taenia саесі) морської свинки на компоненти, дослідженню їх фармако-біофізичних характеристик було показано, що при ступінчастій деполяризації мембрани в переносі вихідного струму приймають участь потенціалкеровані К+ канали затриманого випрямлення та два типи КСа каналів, що узгоджується з літературними даними (Жолос та н. 1986, Yamamoto et al 1989). Показано наявність паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК, та паксиліннечутливого компоненту. Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), які переносяться через КСа великої провідності, ефективно блокуються наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСа каналів великої провідності не призводив до блокування вихідних струмів, як це було показано для харибдотоксина та ТЕА. На фоні дії паксиліну (100 нМ) ТЕА в концентрації 1 мМ проявляв подальше пригнічення вихідних К+ струмів. ВАХ паксиліннечутливого компоненту виявила, що цей струм проявляє потенціалзалежн властивості, тобто зі збільшенням рівня деполяризації відбувається збільшення його амплітуди. Поряд з цим вольт-амперна характеристика має перегин в област максимуму кальцієвого струму, що може свідчити про залежність цього струму від внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Це вказує на наявність паксиліннечутливого компоненту К+ струмів, який блокується менш селективними блокаторами, такими як ТЕА та харибдотоксин, останній ма блокуючий вплив, як на ВК канали (Knaus et al. 1994, Orio et al. 2002), так на КСа проміжної провідності (ІК) (Bychkov et al. 2002, Edwards et al. 1998; 2000). З’ясування природи цього компоненту К+ струму вимагає застосування більш селективних блокаторів К+ каналів.
Другий вагомий компонент КСа струму переноситься через КСа канали малої провідності, для яких селективним блокатором виступає апамін (Shuba et al. 1981, Shuba et al. 2000, Burnham et al. 2002). Але, як було показано (Повстян та ін. 2000), апамін ма побічну дію у вигляді активації каналів, що переносять неселективний катіонний струм. Для усунення невизначеності дії апаміну, в наших дослідах в якост блокатора SК каналів було застосовано d-TK, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів та широко застосовується, як в дослідницьких цілях, так і в медицині (Wenningmann et al. 2001). Але окрім впливу на нікотинові холінорецептори існують дані про його додаткові властивості, як блокатора КСа каналів (Wang et al. 1999, Barfod et al. 2001). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонн струми, що протікають через мембрану ГМК taenia cеасі морської свинки.
Ефект блокування IK(Ca) аплікацією d-ТК досягав максимума через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладення блокатора. IK(Ca), що переноситься через SК канали, не проявляв на відміну від паксилінчутливого струму, часозалежно нактивації та потенціалзалежних властивостей. Крива ВАХ цього струму мала максимум в діапазоні + 30, + 50 мВ, що не співпадає з максимумом кальцієвого струму котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля +10 мВ. Подібні ефекти було описано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), та були пов’язані з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо. Поряд з цим дослідження, проведені по вивченню впливу d-ТК на вхідні Са2+ струми показали, що d-ТК не впливає на потенціалзалежні Са2+ канали L типу, котрі були виявлені на мембрані ГМК (Yamamoto et al. 1989, Жолос та ін. 1986, Зима та ін. 1994), що збігається з літературними даними (Wang et al. 1999).
Окрім наведених відмінностей встановлено, що ВК та SK канали сильно відрізняються по чутливост до ТЕА, неселективного блокатора К+ каналів. Як було сказано вище, ВК канали блокуються при додаванні до зовнішнього розчину ТЕА в низьких концентраціях, що в наших дослідах складало 1 мМ. В той же час SK канали, що з успіхом блокувались низькими концентраціями d-ТК (50 мкМ), виявились нечутливими до аплікації ТЕА навіть в концентраціях 4 – 5 мМ, що узгоджується з літературними даними (Latorre et al. 1983, Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). Більше того, було показано (Blatz et al. 1986), що ТЕА не виявля блокуючої дії на SK канали навіть в великих концентраціях (20– 25 мМ).
Одною з найважливіших характеристик IK(Ca), що переноситься як через ВК канали так і SK канали, є чутливість цих каналів до зміни [Са2+]i. З літературних джерел відомо (Becker et al. 1989, Ganitkevich et al. 1991), що при фізіологічних умовах [Са2+]i в ГМК знаходиться в діапазоні 100 – 120 нМ. При деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу до 0 мВ [Са2+]i різко зростає, досягаючи рівня 1000 нМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 – 300 нМ, на якому продовжу триматися протягом декількох секунд до припинення деполяризації. Аналогічн дані були отриманні в дослідах на тонкому кишечнику мишей (Vogalis et al. 1997). В цій роботі було визначено порогову [Са2+]i необхідну для активації К+ каналів, що становила 85 нМ. В той же час для активації ВК каналів необхідна значно вища [Са2+]i, ніж для SК каналів. Проведені досліди з використанням іонів Со2+ в зовнішньому розчині також підтверджують дані, що для активації ВК каналів необхідне значне підвищення [Са2+]i за рахунок надходження іонів Са2+ ззовні клітини, та/або вивільнення їх з внутрішньоклітинного депо.
Відносний вклад кожного з компонентів в сумарний вихідний струм варіював у різних клітин, але в більшості випадків величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихідного трансмембранного струму переноситься через потенціалкеровані К+ канали “затриманого випрямлення” та ТЕАчутлив ВК канали. В свою чергу, більш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варіював наступних межах: 30 – 45% для Са2+незалежного К+ струму “затриманого випрямлення”, 40 – 50% для паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК канали, 5 – 15% для ТЕАчутливого IK та 5 15% для d-ТКчутливого IK(Ca), що переноситься через SК канали. Потрібно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадали з результатами отриманими за допомогою віднімання окремих компонент вихідного струму.
Отриманні нами дані свідчать, що в ГМК taenia cаесi морської свинки окрім викликаних вихідних калієвих струмів можуть також виникати СВС. На сьогоднішній день аналогічні струми вже описані в багатьох ГМК: трахеї, різних відділах кишечнику та кровоносних судин (Шуба 1965, Bolton et al. 1996). Фізіологічна роль СВС, поки що достеменно невідома.
Велике зацікавлення викликає питання з приводу джерела Са2+ , необхідного для активації кожного зі згаданих раніше компонентів IK(Ca). На сьогодні існує багато думок з цього приводу. Проведені нами досліди, а також отриманні раніше дані (Cole et al. 1989, Повстян та ін. 1997) наочно демонстрували, що амплітуда вихідного К+ струму, через наявність Са2+чутливо компоненти, сильно залежить від кількості Са2+, що входить до клітини через потенціалкеровані Са2+ канали під час деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу. Блокування цих каналів іонами Со2+ призводило до значного пригнічення вихідного струму. Нездатність паксиліна пригнічувати вихідний струм в умовах блокування входу іонів Са2+ в клітину може слугувати доказом того, що для активації КСа каналів великої провідності ГМК taenia caeci морської свинки необхідне значне підвищення [Са2+]i в даному разі за рахунок входу іонів Са2+ ззовні через потенціалкеровані Са2+ канали L-типу. В той самий час, для активації SК потрібно незначне підвищення [Са2+]i вище порогового рівня, як зазначалось раніше, близько 85 нМ (Vogalis, Goyal 1997).
В той же час було виявлено, що іони Ca2+, які спонтанно вивільняються з саркоплазматичного ретикулуму (СР), так звані Са2+ спарки, також можуть викликати активацію КСа , при цьому активність каналів буде проявлятись у вигляді СВС (Bolton et al. 1996, Gordienko et al. 1998, Bayguinov et al 2001). Са2+ спарки призводять до локального підвищення [Са2+]i, що в свою чергу призводить до активації невеликої кількості КСа (10-100) (Бурый та ін. 1992, Benham et al. 1986), які генерують появу СВС. Лише суттєве вивільнення Са2+ з СР (викликане наприклад аплікацією кофеїну) може призвести до активації великої кількості КСа каналів та викликати появу вихідного інтегрального макроструму (Гордиенко та ін. 1995, Повстян та ін. 2000). Однак в реальних умовах, подібне масове вивільнення Са2+ депо видається мало ймовірним.
В одній з недавніх робіт, що стосувалась вивчення впливу апаміна на іонні струми зольованих ГМК ШКТ (Kong et al. 2000) було показано, що СВС можна розділити на два типи – великої та малої амплітуди. Перші блокувались харибдотоксином та утворювались завдяки активації ВК каналів, а другі − апаміном, і, відповідно формувались SК каналами. Проведені нами досліди показали, що паксилін ефективно блокував СВС великої амплітуди, при цьому частота СВС мало амплітуди майже не змінювалась, і, відповідно, не блокувались паксиліном. що узгоджується з наведеними даними. В той же час d –TK призводив до блокування СВС малої амплітуди, що може свідчити про те, що вони формуються за рахунок активації SК. ТЕА неселективний блокатор К+ каналів, на відміну від паксиліна, блокуючи СВС великої провідності також незначно пригнічував СВС малої амплітуди. Як було показано, на інтегральних струмах існує К+ провідність, яка нечутлива до паксиліну, але блокується ТЕА, і відповідно робить вклад в СВС малої амплітуди.
Підсумовуючи вище згадані дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia cаесi морської свинки снує щонайменше два компоненти IK(Ca). Ці компоненти відрізняються між собою не лише провідністю каналів, через які вони переносяться, але і їх чутливістю до [Са2+]i та змін мембранного потенціалу, а також відрізняються кінетичними характеристиками. Окрім наведеного вище, ц канали відрізняються чутливістю до блокаторів (d-TK, паксиліну, ТЕА). Так, d–TK виступає ефективним блокатором SК каналів ГМК ШКТ та може бути використаний, як нструмент для розділення та вивчення іонних струмів.
