Реферат: Основні фармакологічні ефекти кумаринів місного засобу - водного екстракту з трави буркуну
Вивчення антиагрегаційної активності екстракту буркуну і ФіБСу проведено в дослідах in vitro за методом Борна на багатій тромбоцитами плазмі кров людини на агрегометрі THROMLITE – 1006 А (“Биохиммак”, Росія) на базі Фізико-хімічного інституту ім. А.В. Богатського НАН України. Виражаємо щиру вдячність проф. Карасьовій Т.Л. за надання консультативно-методичної допомоги при виконанні досліду. Суть методу полягає в перевірці здатності досліджуваних об'єктів інгібувати АДФ викликану агрегацію тромбоцитів крові після їхньої попередньої інкубації з плазмою крові людини (G.V. Born, 1962). Об'єктами даної перевірки були 3 серії екстракту буркуну лабораторні зразки і препарат порівняння біогенний стимулятор ФіБС з урахуванням розведення в кюветі агрегометра в 7 разів. Антиагрегаційна активність наведена у відсотках інгібування (I %) агрегації тромбоцитів у порівнянні з контролем.
Вивчення впливу екстракту буркуну і ФіБСу на коагуляційний гемостаз при курсовому введенн було проведено на 51 кролі породи Шиншила, масою 3,0– 4,7 кг, розподілених на 9 піддослідних груп: 3 контрольних (по 5 кролів) і 6 піддослідних (по 5–7 кролів). Показники гемостазу у тварин вивчали до початку досліду (вихідний рівень), на 7, 14, 21 дні введення, через 1 і 2 тижні після закінчення курсу. Екстракт буркуну і ФіБС вводили тваринам підшкірно в дозах: 0,3; 1,0 і 3,0 мл/кг для кожної піддослідної групи, відповідно. Контрольним тваринам вводився фізіологічний розчин в аналогічних об’ємах. Визначали наступні показники коагулограми: тромбіновий, протромбіновий, активований парціальний тромбопластиновий час і вміст фібриногену оптичним методом на турбідиметрічному гемокоагулометрі фірми "Солар" (Мінськ) з використанням реактивів фірми "НПО Ренам" (Москва) згідно стандартним методикам (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) з урахуванням методичних рекомендацій до приладу (В.В. Дмитриев, 1997). Хагеман-залежний фібриноліз визначали за Kowalski, Kopec, час лізису еуглобулінового зсідка за Kowarzyk, Buluk (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) та показник фібринолітичної активності згідно методичним рекомендаціям (Ю.О. Киселевский и др., 1997).
Вплив екстракту буркуну на перебіг експериментальної гіфеми – крововиливу у передню камеру ока (Г.В. Самсонов та ін., 1985) проводили на кролях породи Шиншила, статевозрілих, масою 3,6–5 кг. Усього використано 15 кролів (30 очей), розподілених нарівно на 3 групи: 1 група – контрольна патологія (без лікування); 2 і 3 групи – модель гіфеми з наступним введенням екстракту підкон’юнктивально і підшкірно, відповідно. Екстракт буркуну вводився через 4 години після створення гіфеми в дозі 0,3 мл/кг протягом 10 днів.
Оцінку коагуляційної і фібринолітичної активності слізної рідини проводили за Е.Г. Сомовим, В.В. Бржеским (1992). Внутрішньоочний тиск вимірювали за допомогою тонометра Маклакова масою 7,5 г у ті ж терміни.
Статистичну обробку даних проводили з використанням методів параметрично непараметричної статистики за допомогою програми ”Microsoft Excel для Windows 2000, Statistica 5.5 (С. Гланс, 1999).
Результати досліджень та їх обговорення. Наявність кумарину виявляли шляхом зіставлення на хроматограмах зон випробуваного розчину і свідка – синтетичного кумарину. При цьому кумарин виявляється у вигляді зони, що флуоресцирує зеленувато-жовтим кольором. Наявність оксикумаринів підтверджено зіставленням хроматограм випробуваного розчину з достовірними речовинами-свідками – скополетином умбеліфероном, що подані таким чином: умбеліферон – зона, що флуоресцирує яскраво-блакитним кольором (у середній частині хроматограми), скополетин – зона, що флуоресцирує блакитним кольором (у нижній частині хроматограми).
Спектри поглинання випробуваних розчинів мають виражений максимум, що однозначно дозволяє проводити кількісне визначення кумаринів при довжині хвил поглинання кумарину, яка дорівнює 272 нм. На підставі фактичних даних встановлено, що вміст суми кумаринів у екстракт буркуну (у перерахунку на кумарин) складає не менше 0,09 %.
Дані, отримані при вивченні гострої токсичності, дозволяють віднести екстракт буркуну до практично нетоксичних препаратів (LD50>50 мл/кг) за класифікацією К.К. Сидорова (1973).
Тривале введення на протязі 30 днів у дозах 0,3 і 1,0 мл не сприяє будь якому токсичному впливу на організм різних видів піддослідних тварин. Це підтверджується біохімічними показниками крові та відсутністю деструктивно-дистрофічних змін у тканинах внутрішніх органів кролів при гістоморфологічних дослідженнях. Вивчення ультраструктури гепатоцитів проводилось після 21-денного введення екстракту буркуну і ФіБСу у дозі 0,3 мл/кг. Слід зазначити – в гепатоцитах кролів, що отримували екстракт виявлено накопичення кількості рибосом, полісом, мітохондрій, зернистої ендоплазматичної сітки, глікогену, що свідчить про посилення білоксинтезуючої, енергообразуючої функцій печінки, що в цілому відображає активацію метаболічної діяльності, спрямованої на збільшення в клітинах пластичного матеріалу. Підвищення клітинної резистентності під впливом екстракту буркуну є одним з істотних компонентів посилення загальної резистентност організму.
Доклінічна фармакологічна оцінка лікарських засобів з натуральної сировини, призначенних для стимуляції неспецифічної резистентност та адаптаційних можливостей організму, має свої особливості. Це пов’язано, в першу чергу, з наявністю у препаратах названої групи складних комплексів біологічно активних сполук з широким спектром фармакологічної дії. Тому вивчення рівня їх біологічної активності проводять на спеціальних тестах. На дріжджовому тесті встановлено, що екстракт буркуну володіє високою стимулюючою активністю. Три серії виявляють практично однаковий вірогідно виражений ефект (1050–1100 %). Необхідно відзначити, що рівень біологічної активності ФіБСу складає 110–120 %. Таким чином, у порівнянні з ним рівень біологічної активності екстракту буркуну у 9 разів вище.
На парабіотичному тесті перевірені три серії екстракту буркуну у наступних концентраціях: нативний препарат (per se), 0,1 і 0,01 % розчин. Найбільш високі результати були отримані при перевірці 0,1 % розчину: активність у даній концентрації перевищувала контрольні показники, у середньому, на 48,7 %.
На стрихніновому тесті встановлено, що попереднє введення екстракту буркуну у дозах 0,2; 0,3 і 0,5 мл викликає достовірне збільшення тривалост життя мишей на 86,9; 27,3 і 36,3 %, відповідно. Крім того, на фоні 100 % загибелі контрольних тварин при введенні стрихніну вижило 11; 11 і 22 % тварин, відповідно (р<0,05).
На фоні розвитку гострої гістотоксичної гіпоксії встановлено, що попереднє однократне введення екстракту буркуну у дозі 0,5 мл вірогідно подовжує тривалість життя мишей на 36 % у порівнянні з контролем.
Екстракт буркуну зменшує тривалість гексеналового сну на 20 % у порівнянні з контролем, що свідчить про посилення детоксикуючої функц печінки за рахунок активації мікросомальних ферментів гепатоцитів, метаболізуючих гексенал.
Вивчення гепатозахисних властивостей екстракту буркуну та ФіБСу проводили на моделі токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (CCl4), генез якого пов’язаний з індукцією вільнорадикального окислення ліпідів.
Гостре отруєння ССl4 характеризувалося значними змінами усіх досліджуваних показників. В групі контрольної патолог спостерігалося збільшення масового коефіцієнту печінки, зменшення загального білка, зростання активності трансаміназ у групі контрольної патології АлАТ– на 112,8 % і АсАТ– на 131,9 %, підвищення в сироватці крові проміжних (ДК) і кінцевих (МДА) продуктів окислення ліпідів у 4,3 і 6,7 рази.
Профілактично-лікувальне введення екстракту буркуну сприяло зменшенню коефіцієнта маси печінки та нормалізації загального білка практично до показників інтактних тварин. В групі, яка отримувала ФіБС, коефіцієнт маси печінки був на 25 % вищим (р<0,05).
На фоні попереднього введення екстракту буркуну і ФіБСу активність АлАТ збільшується лише на 62 %, а АсАТ на 74 і 86 %, відповідно (при контрольній патології АлАТ на 112,8 %, АсАТ на 131,9 %) . Профілактично-лікувальне введення вірогідно знижувало цитоліз гепатоцитів. При застосувані екстракту буркуну показники відновилися до рівня інтактних тварин. У групі, що отримувала ФіБС зберігалось достовірне підвищення активност ферментів цитолізу АлАТ і АсАТ на 30 % відповідно (рис. 1).
Рис. 1. Вплив профілактично-лікувального введення екстракту буркуну і ФіБСу на активність АлАТ і АсАТ сироватці крові щурів при гострій нтоксикації CCl4, n=10
* - вірогідно відносно інтактного контролю (р<0,05);
** - вірогідно відносно групи контрольної патології (р<0,05).
Профілактичне введення досліджуваних препаратів сприяло менш виразному запальному процесу: стосовно контрольної патології екстракт буркуну знижав рівень ДК – у 1,8 (р<0,001) та МДА у 1,5 рази (р<0,01), ФіБС у 1,6 (р<0,001) та 1,3 рази (р>0,1) відповідно.
Профілактично-лікувальне введення екстракту буркуну виявило його виражену антиоксидантну активність, на що вказує достовірне зниження ДК і МДА практично до рівня інтактних тварин, у той час, як при застосуванні ФіБСу вони залишались достовірно підвищеними у 2,3 та 3,3 рази відповідно. Аналіз отриманих результатів показав, що обидва засобу володіють гепатопротекторними властивостями, однак екстракт буркуну виявляє більш виражений гепатозахисний ефект. Стабілізація порушень в гепатоцитах здійснюється завдяки корекц переокиснювання ліпідів.
Антитоксичні та мембраностабілізуючі властивості вивчали у кролів різного віку при 30-денному курсовому введенні екстракту буркуну. Через 30 днів від початку введення у піддослідній групі старих кролів (7 років), відзначено зниження відсотка затримки бромсульфалеїну з 35,8 до 22,3 (р<0,02): виведення фарби відбувалося в 1,6 рази швидше щодо вихідного рівня. У групі молодих кролів (1 рік) відсоток затримки бромсульфалеїну після курсового введення екстракту буркуну склав 11,7 % при 15,3 % вихідного рівня (р<0,02), у 1,3 рази прискорювалося виведення фарби в порівнянні з вихідними даними. Різниця у швидкості виведення фарби у молодих і старих кролів до початку досліду складала 2,3 рази, а після закінчення експерименту скоротилася до 1,9 рази.
Виявлено, що курсове введення екстракту буркуну сприя підвищенню осмотичної резистентності еритроцитів (ОРЕ). У групі молодих кролів діапазон ОРЕ збільшився: max границя – з 0,29 % до 0,24 %; min границя – з 0,54 % до 0,53 % NaCl. У групі старих тварин, початок гемолізу був зареєстрований при 0,55 % концентрації NaCl, що супроводжувалося руйнуванням 20 % еритроцитарного пула. Повний гемоліз наставав при 0,3 % концентрації NaCl. Підвищення ОРЕ характеризувалося меншою кількістю одночасно зруйнованих клітин (10 %) у момент початку гемолізу при 0,53 % концентрації NaCl, при цьому повний гемоліз відбувався при більш низькій концентрації NaCl (0,24 %). При вивченн перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) результати дослідження показали, що вихідний рівень перекисного гемолізу еритроцитів у старих кролів на 82 % вище, ніж у молодих. Стійкість еритроцитів до перекисів після закінчення експерименту зросла в групі старих кролів у 2 рази, в групі молодих кролів у 1,4 рази щодо вихідного рівня, тобто різниця між ними скоротилася і склала 21 % (рис. 2).
Рис. 2. Вплив курсового введення екстракту буркуну на ПРЕ у кролів різного віку, контроль (n=5), дослід (n=10)
*- вірогідно в порівнянні з вихідним рівнем (р<0,05);
** - вірогідно в порівнянні вікових груп (р<0,05).
Отримані результати свідчать, що у тварин з віком спостерігається виснаження антиоксидантної системи та зростає потреба у забезпеченні організму додатковою кількістю антиоксидантів. Крім того, дефіцит ендогенних антиоксидантів може бути також пов’язаний із зниженням засвоєння вітамінів та нших фізіологічно-активних речовин у шлунково-кишковому тракті старих тварин.
Виявлено, що вміст водорозчинних антиоксидантів в крові старих кролів до початку експерименту був в значній мірі знижений при порівнянні з молодими (12,4 ± 1,0 мекв/л крові проти 19,3 ± 1,0 мекв/л крові) і становив 64 %. Вміст жиророзчинних антиоксидантів в крові старих тварин відносно молодих склав 79,2 % (8,0 ± 0,6 мкекв/л крові проти 10,1 ± 0,8 мкекв/л крові). Активність каталази в плазмі крові 7-річних кролів (315,2 ± 21,2 мккат/л) при порівнянні з 1- річними (502,4 ± 34,1 мккат/л) складала 62 % (р<0,05).
Застосування екстракту буркуну викликало у молодих кролів суттєве підвищення вмісту водо- і жиророзчинних антиоксидантів вже через 15 днів після введення до 118 і 109 %, через 30 днів до 132 і 116 % відповідно. Відзначалося також вірогідне зростання активності каталази на протязі експерименту, що складало через 15 30 днів 110 і 116 %.
У старих кролів на 15 день після введення екстракту буркуну, на відміну від молодих, не відзначалося вірогідних змін вмісту жиророзчинних антиоксидантів та активност каталази в крові, а спостерігалась лише тенденція до підвищення їх рівня. Вміст водорозчинних антиоксидантів на 15 день спостереження підвищився до 113,7 % щодо вихідного рівня (р<0,01). Через 30 днів рівень зазначених показників в крові становив, а саме: вміст водо- жиророзчинних антиоксидантів 130,6 і 112,5 % відповідно (р<0,05). При дослідженні активності каталази в печінці молодих і старих кролів після курсового введення екстракту буркуну встановлено, що активність ферменту у старих тварин підвищувалась до 132,8 % (35,2 ± 2,2 мккат/г тканини) проти контролю (26,5 ± 2,3 мккат/г тканини), а у молодих – до 128,0 % (49,4 ± 3,2 мккат/г тканини) проти контролю (38,6 ± 2,8 мккат/г тканини).
Встановлена висока антиагрегаційна активність екстракту буркуну у дослідах in vitro (на 70–80 % інгібуючи агрегацію тромбоцитів крові у порівнянні з контролем), що практично в 3 рази перевищує показники ФіБСу.
Отримані результати показників гемостазу свідчать про те, що обидва препарати володіють гіпокоагулянтними властивостями, але екстракт буркуну викликає більш виражений гіпокоагулянтний ефект. Так, через тиждень від початку введення (доза 0,3 мл/кг) відбувається достовірне подовження тромбінового часу (ТЧ) на 30 % (р<0,05), а через два три тижні на 77 % (р<0,001; р<0,02), в той час, як ФіБС викликає подовження ТЧ на 55 і 60 %, відповідно.
При дослідженні протромбінового часу (ПЧ) відзначалось наступне: наприкінц першого тижня введення екстракту буркуну подовження ПЧ склало 37 % (р<0,02) і 13 % (р>0,05) при введенні ФіБСу. Через два тижні ПЧ збільшилося на 67 % (р<0,02) для екстракту і на 27 % (р<0,05) для ФіБСу. Через три тижні подовження цього показника для екстракту буркуну склало 74 % (р<0,02) і 35 % (р<0,02) – для ФіБСу.
По тесту активованого парціального тромбопластинового часу (АПТЧ) спостерігалося достовірне збільшення цього показника протягом курсового введення екстракту буркуну (на 33, 53, 68 %, відповідно). У ФіБСу ці зміни були недостовірними. Вміст фібриногену після двох тижнів введення екстракту буркуну знизився на 41 % (р<0,05) зберігався на цьому рівні через три тижні. При тритижневому введенні ФіБСу цей показник практично не відрізнявся від вихідних даних.
У серії експерименту (доза 1,0 мл/кг) зміни досліджуваних показників крові носили характер аналогічний дозуванню 0,3 мл/кг. Однак через три тижні препарат ФіБС вже вірогідно викликає подовження ПЧ на 54 % при рівнобіжному зниженн вмісту фібриногену на 42 %. Екстракт буркуну викликав збільшення АПТЧ, ПЧ, що практично відповідало попереднім даним. ТЧ через три тижні подовжився на 68 % при зниженні вмісту фібриногену на 50 % (р<0,001).
При введенні 3,0 мл/кг отримані дані зберігали тенденцію, аналогічну змінам показників попередніх серій експерименту. При цьому обидва засоба виявили статистично значиму гіпокоагулянтну дію. Встановлено, що екстракт буркуну володіє більш виразним гіпокоагулянтним ефектом у порівнянні з ФіБСом: через три тижні ТЧ подовжилося на 85 %, а при введенні ФіБСу – на 73 %. Відзначено подовження ПЧ на 87 % (екстракт буркуну) і на 61 % (ФіБС); Показник АПТЧ під впливом екстракту збільшився на 88 % проти 63 % – у ФіБСу. Вміст фібриногену зменшився на 68 і 64 %, відповідно. Через тиждень післядії у ФіБСу показники гемостазу практично відповідали вихідному рівню. Для екстракту буркуну зберігалося подовження ТЧ на 32 % (р<0,01); ТЧ і АПТЧ на 13 % і зменшення вмісту фібриногену на 61%. Через два тижн післядії ТЧ практично відповідав вихідному рівню. Подовження ПЧ і АПТЧ склало 18 12 % (р<0,05), відповідно, а вміст фібриногену був нижче вихідного рівня на 18 % (р>0,05). Таким чином, екстракт буркуну і ФіБС при курсовому тритижневому введенні виявляють односпрямовану гіпокоагулянтну дію. Однак, екстракт буркуну за всіма показниками виявив більш виражені гіпокоагулянтн властивості, у 1,3–1,5 рази перевищуючи показники ПЧ і АПТЧ ФіБСу (у трьох дозуваннях). 10 – кратне збільшення дози екстракту буркуну не викликало значимих зрушень досліджуваних показників, що може бути пов'язане з позитивним фармакологічним впливом на поліпшення кровообігу, активацію метаболізму, зменшення реабсорбції і гідрофільності в нірках. За даними Р.Б. Косуба (2003) відзначено стимулюючий вплив екстракту буркуну на калій- і натрій-уретичн показники. Враховуючи, що зміни зсідання можуть залежать і від стану фібринолітичної системи, досліджували показники фібринолізу. На відміну від ФіБСу екстракт буркуну при всіх дозах виявляє стимулюючу дію на фібринолітичну ланку гемостазу, що підтверджується певним скороченням часу еуглобулінового лізису (показник фібринолітичної активності збільшився практично в 1,3 рази) зміцненням активності Хагеман-залежного фібринолізу – каолін-індукований лізис фібринових згустків скоротився на 21, 28, 29 % відповідно.
