Реферат: Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності
Вміст антиоксидантів в антральній рідині фолікулів та зв’язок з фізіологічним станом яєчників корів. Інтенсивність окисних процесів регулюється рівнем природних антиоксидантів, що підтверджується їх вмістом та співвідношенням відновлених і окиснених форм у фолікулах. Так, в антральній рідині фолікулів яєчників корів вміст відновленої форми глутатіону становить 17,3–33,7 мг%, аскорбінової кислоти – 10,0–21,2 мкг/мл, окиснених форм, відповідно, 10,0–19,1 мг% і 8,3–14,7 мкг/мл, загального глутатіону 27,0–51,4 мг%, аскорбінової кислоти з окисненими продуктами – 21,9–34,0 мкг/мл. Найвищий вміст відновлених форм антиоксидантів (Г-SH 24,5–33,7 мг%, АА 12,9–21,1 мкг/мл) у період “пізнього” жовтого тіла. Аналіз відношення між відновленими і окисненими формами антиоксидантів виявив найвищий відсоток АА у великому і середньому фолікулах яєчника “фолікулярного зростання” (68,2–71,4 : 35,4–38,6%), та зниження у фолікулах малого розміру всіх інших фізіологічних станів яєчників (59,9–64,0 : 36,1–50,6%) і найменший у великому фолікулі яєчника свіжої овуляції” (55,4 : 49,2%). Подібні синхронні зміни з АА, відсотку Г-SH та Г-SS-Г у великому і середньому фолікулах “свіжої овуляції” (53,9–59,1 : 40,9–46,1%) свідчать про тісний зв’язок між вказаними антиоксидантами. Найвищий вміст Г-SH (69,4±5,32%) виявлено у великому фолікулі яєчника “пізнього жовтого тіла”.
Дихальна та відновна активності ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) корів in vitro. Закономірності розвитку фолікулів, клітин гранульозного шару, підтверджуються інтенсивністю дихання ооцитів. Виявлена обернена залежність між поглинанням кисню ОКК у середовищ Дюльбеко, 199, Іґла і RPMI–1640 та розміром фолікула, пряма – з наявністю компактністю кумулюсу (великі за діаметром, без кумулюсу – 0,09–0,19, середні, з розпушеним кумулюсом – 0,11–0,30, малі, з компактним кумулюсом – 0,17–0,47 нг-атом О/ооцит/хв). Отже, ооцити з компактним кумулюсом нтенсивно поглинають кисень, що з втратою компактності – знижується. При дослідженні у ФСБ Дюльбеко після інкубування 24 год, ОКК проявляють вищу дихальну активність: з компактним кумулюсом малого фолікула на 17,6%, з розпушеним кумулюсом середнього фолікула – 36,3% і без кумулюсу великого фолікула – 44,4%. Інкубування ооцитів 24 год у середовищах ТС 199 та Іґла призводить до зменшення дихальної активності, порівняно з свіжоотриманими: у ОКК з компактним кумулюсом малого фолікула, у першому – нижча на 10,3%, другому на 7,7%; з розпушеним кумулюсом з середнього та без кумулюсу з великого фолікулів у обох середовищах майже не змінюється (ТС 199 – 0,20–0,22 і 0,13–0,14; Іґла – 0,24–0,26 0,19–0,22 нг-атом О/ооцит/хв). У RPMI-1640 використання кисню ооцитами з компактним кумулюсом малого фолікула також не змінюється (0,45±0,090 нг-атом О/ооцит/хв), але знижується на 30,0% – з розпушеним кумулюсом середнього фолікула та зростає на 15,7% – без кумулюсу великого фолікула.
Вивчення окремих ланок утилізації кисню показало, що у свіжоотриманих ооцитів при інгібуванн гліколізу дихальна активність зростає: у ОКК з розпушеним кумулюсом у 2,4 рази та без кумулюсу в 2,9 рази і знижується з компактним кумулюсом на 23,6%.
ОКК проявляють реакцію-відповідь на доданий АТФ – споживання кисню зростає з розпушеним кумулюсом на 13,4%, з компактним – на 39,9%, ”голі” не реагують. Через 24 год нкубації знижується реакція – відповідь на доданий АТФ у ОКК з розпушеним компактним кумулюсом на 37,5–40,0%, що свідчить про здатність забезпечувати енергетичні потреби окисненням запасів власних субстратів та підтримувати даний процес за рахунок клітин – симбіонтів (кумулюсу), а при нестачі поживних речовин у середовищах культивування можливе зворотне постачання їх з ооцита до клітин кумулюсу. НАД-залежна ділянка ланцюга дихання у ”голих” ооцитів не активна, а в ОКК з компактним кумулюсом, використання кисню зростає на 57,2%, з розпушеним знижується на 79,1%. Сукцинат стимулює споживання кисню ОКК з компактним кумулюсом на 38,4%, з розпушеним на 70,0% та без кумулюсу на 13,0%. Ооцити проявляють значну інтенсивність немітохондріальних окисних процесів (нг-атом О/ооцит/хв): з компактним кумулюсом 0,10±0,006, без кумулюсу – 0,13±0,006 і з розпушеним 0,27±0,006.
Вивченням окисно-відновних процесів ооцитів у середовищі RPMI-1640 виявлена пряма залежність між компактністю кумулюсу та нтенсивністю дихання ооцитів (ОКК з компактним кумулюсом 0,47±0,08 нг-атом О/ооцит/хв, нижча на 36,2% з розпушеним і найнижча – 0,19±0,05 нг-атом О/ооцит/хв – без кумулюсу) обернена – з відновною активністю (без акцептора електронів: ОКК з компактним кумулюсом – 16,0±5,55 пкг К3.../ооцит/хв, а ооцити з розпушеним та без кумулюсу виявляють однакову відновну активність – 18,3 пкг К3.../ооцит/хв). Встановлена залежність підтверджує симбіотичн взаємодії ооцитів з кумулюсом (гранульозою). Акцептор електронів у середовищ культивування знижує дихальну активність ооцитів з компактним кумулюсом та голих”, відповідно, на 29,8% та 68,5%, а з розпушеним – не змінює (0,31±0,11 нг-атом О/ооцит/хв). При цьому, відновна здатність зростає у всіх групах ооцитів: з компактним і розпушеним кумулюсом у 6,4, без кумулюсу – в 11,1 рази. Гальмування активності гліколізу підвищу дихання ооцитів: на 52,4% з компактним кумулюсом та 22,5% розпушеним і зменшу відновну активність, відповідно, на 58,0% і 40,0%. У ооцитів без кумулюсу дихання не змінюється (0,06±0,00 нг-атом О/ооцит /хв), а відновна здатність підвищується на 32,3%. Використання аміталу знижує дихальну активність у ооцитів з компактним кумулюсом на 89,5% і відновну – на 16,7%, з розпушеним кумулюсом, відповідно, на 67,5% і 42,9%. У ооцитів без кумулюсу дихання не змінюється (0,06 нг-атом О/ооцит/хв), а відновна здатність – знижується на 83,4% (до 50,0±34,00 пкг К3.../ооцит/хв). Отже, при забезпеченн субстратами, ооцити без кумулюсу отримують енергію, головним чином, через гліколіз; з компактним кумулюсом – споживання кисню (генерація АТФ) визначається активністю циклу трикарбонових кислот; з розпушеним кумулюсом займають проміжне місце – підвищений гліколіз та збережене дихання.
При інгібуванн активності ЦХО встановлено у ОКК з компактним кумулюсом істотне підвищення (у 2,4 рази) відновної здатності та зниження використання кисню (до 0,06 нг-атом О/ооцит/хв), з розпушеним – зменшення відновно активності на 85,8% та збільшення споживання кисню на 23,0%. У ооцитів без кумулюсу азид натрію підвищує дихання на 85,0%, а відновну здатність – знижує на 44,6%. При стимулюванні НАДН-редуктазних процесів у ОКК з компактним кумулюсом підвищується споживання кисню (азидрезистентного) та відновна активність, відповідно, на 62,5 та 7,3%; з розпушеним кумулюсом – дихання майже відсутн (0,09±0,05 нг-атом О/ооцит/хв), а транспорт електронів зростає більше ніж у 12 разів; без кумулюсу – споживання кисню знижується на 75,0%, а відновні процеси підвищуються на 60,5%. Як наслідок, за рахунок вільнорадикального окиснення жирних кислот, ОКК з компактним кумулюсом споживають 50,0% кисню (азидрезистентного) та транспортують 23,1% відновних еквівалентів; з розпушеним кумулюсом та без кумулюсу – дихальна активність не змінюється, а відновна, відповідно, у перших зростає на 57,2% (до 163,3±24,60 пкг К3.../ооцит /хв), у других знижується на 23,9%.
Культивування ембріонів. Використання середовищ культивування (ТС 199, Іґла, RPMI-1640) з додаванням фетальної та еструсної сироваток, антиоксидантів, клітин гранульози, гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів, інсуліну та гепарину забезпечує повноцінний розвиток ембріонів. Ооцити, з компактним кумулюсом запліднюються та розвиваються до бластоцисти, а з іншими морфологічними характеристиками, розвиток до пізніх стадій припиняється. Додавання антиоксидантів 0,01мл на 1мл середовища культивування (суміш відновленої форми глутатіону і аскорбінової кислоти, відповідно, 15,3 і 4,4мг в 1,0мл), проявляє позитивну дію на розвиток ембріонів. Із 79 клітин, через 144 год з моменту запліднення, виявлено 5 ембріонів (6,3%): 4 ранніх і 1 пізня морула. Аналогічні дослідження проведені з використанням середовищ Іґла та RPMI-1640. Отримано ембріонів, відповідно, 5 (7,5%) – 3 ранні і 2 пізні морули із 67 та 6 (8,3%) – 4 ранні і 2 пізні морули із 72 запліднених ооцитів.
Результати досліджень свідчать, що для запліднення ооцитів та вирощування ембріонів найефективніше проводити культивування у два етапи: 1) культивування (16–18 год) і запліднення (16–18 год) ооцитів у середовищах ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які містять: 10% фолікулярної рідини, 10% еструсної сироватки крові корів, 10% фетальної сироватки крові, клітини гранульозного шару фолікулів, 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Заміну середовища проводити перед заплідненням та після 16–18-годинного спільного культивування ооцитів і сперміїв; 2) культивування ембріонів у середовищах ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які містять, крім вище перерахованих компонентів, 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів. Заміну середовища проводити через кожні 48 год протягом культивування.
Розділення періоду культивування на два окремі етапи і, відповідно, використання гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки в складі середовищ вирощування сприяє розвитку ембріонів до стадії бластоцисти. Найкраще розвиваються ембріони в середовищі RPMI-1640. За 10 діб культивування отримано 18,4% бластоцист і в тому числ 7,2% без прозорої оболонки. Менше бластоцист при культивуванні в середовищах Іґла та ТС 199, відповідно, 28 (14,9%) і 17 (11,0%). З них без прозоро оболонки, відповідно, 11 (5,8%) та 2 (1,3%).
Окисно-відновн процеси в бластоцистах корів. В процесі розвитку ембріони використовують кисень та проявляють відновну здатність. Існує пряма залежність стадій розвитку бластоцист з дихальною активністю (ранні бластоцисти 0,09±0,01 нг-атом О/ембріон/хв, на 10,0% вище у пізніх, максимальна у бластоцист без прозорої оболонки – 0,11±0,02 нг-атом О/ембріон /хв) і обернена – з відновною (ранні – 37,0±9,00 пкг К3…/ембріон/хв, у пізніх нижча на 21,7% і у бластоцист без прозорої оболонки найнижча – 13,0±2,01 пкг К3…/ембріон/хв).
Вивченням особливостей використання кисню ембріонами виявлено, що гальмування гліколізу стимулю дихальну активність у ранніх бластоцист на 29,1%, пізніх на 40,2%, у бластоцист без прозорої оболонки – у два рази. При цьому, швидкість відновлення фериціаніду у перших та других зменшується, відповідно, на 69,1% та 56,6%, у третіх – підвищується на 20,7% (63,0±32,0 пкг К3.../ембріон /хв). Отже, у ранніх та пізніх бластоцист, відповідно, 69,1 та 56,6% і без прозорої оболонки – не більше 21,0% потоку електронів генеруються гліколізом і транспортуються в позаклітинний простір.
При інгібуванн НАД-залежної ділянки дихальна активність бластоцист знижується: ранніх стадій, пізніх та без прозорої оболонки, відповідно, на 66,3, 43,8 та 65,7%. Відновна здатність також знижується у перших на 17,9%, других на 10,5%, а без прозорої оболонки – підвищується більше ніж у два рази (150,0±25,07 пкг К3.../ембріон/хв). Аналогічно, зі зміною стадії розвитку ембріонів до бластоцисти без прозорої оболонки знижується азидрезистентна компонента дихання з 67,7% до 29,1% та відновна активність на 38,7% і 28,4%.
Інгібітор вільнорадикального окиснення жирних кислот (NaEДTA) гальмує споживання кисню у бластоцист на ранній та пізній стадіях, відповідно, на 59,1% і 67,3%, без прозорої оболонки – на 37,5% (від спожитого кисню азидрезистентною компонентою дихання). Наведен дані свідчать, про наявність в ембріонів альтернативних оксидазних оксигеназних процесів.
ВИСНОВКИ
У дисертац узагальнено роль окисно-відновних процесів у формуванні та забезпеченн фізіологічних показників якості і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг та регуляцію окисно-відновних процесів при дозріванні і капацитації сперміїв поза організмом, ооцитів – у процесі дозрівання та після запліднення – росту ембріонів, виявлені чинники, як забезпечують оптимальне співвідношення процесів окиснення та відновлення у статевих клітинах, встановлені маркери інтенсивності вказаних процесів. На підставі результатів досліджень, розроблені практичні пропозиції з об’єктивного вірогідного оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, корекц нтенсивності окисно-відновних процесів у сперміях та ооцитах, підвищення запліднювальної здатності сперміїв, запліднення корів і телиць in vivo та ооцитів in vitro.
1. Сперм свіжоотриманих еякулятів чорно-рябих бугаїв молочних порід характеризуються такими біохімічними та фізіологічними показниками: інтенсивність використання кисню 5,3–60,7 нг-атом О/108 сперміїв/хв, швидкість відновних процесів 0,1–26,0 мкг К3…/108сперміїв/хв, активність СДГ 0,5–55,0 мкМ/хв/л, ЦХО 0,5–100,0 мкМ/хв/л, вміст фракцій білків – альбуміну 5,5–38,9%, глобулінів: a- 15,1–69,1%, b- 4,0–32,1%, g- 12,2–54,0%, аскорбінової кислоти 5,0–110,0 мкг/мл, продуктів окиснення (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот) 0,5–45,0 мкг/мл та сумарний вміст 5–150,0 мкг/мл. Величини біохімічних і фізіологічних показників проявляють значну мінливість внаслідок індивідуальних особливостей плідників, черговості отримання еякулятів, сезону року, віку, походження бугаїв, інших факторів.
2. У сперм бугаїв існують позитивні кореляції сильні (h = 0,70–0,74) та середньої сили (h = 0,46–0,65) між інтенсивністю використання кисню, мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, активністю окисних ферментів. Неоднозначна сила взаємозв’язків між корелюючими біохімічними показниками свідчить про інтенсивність окисно-відновних процесів і визнача фізіологічні показники сперміїв. Сильна кореляція (h = 0,70–0,71) між активністю СДГ, ЦХО і фізіологічними показниками сперміїв дає підстави до використання обох ферментів для оцінювання якості та запліднювальної здатності сперміїв свіжоотриманих і розморожених еякулятів бугаїв.
3. У сперм бугаїв існує оптимум окисно-відновних процесів та показників, а саме, дихальна активність 17,3–20,9 нг-атом О/108сперміїв/хв, компоненти: мітохондріальна 8,5–10,4 та азидрезистентна 9,9–12,7 нг-атом О/108сперміїв /хв, активність ЦХО 31,8–36,7 і СДГ 14,9–17,5 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти і продуктів окиснення 41–50 і менше 10 мкг/мл, альбуміну 15–20%, глобулінів: a- 30–50%, b- і g- менше, відповідно, 15 25%. Оптимум вказаних процесів і показників характерний для еякулятів за об’ємом 2,0–6,0 мл, концентрацією сперміїв 0,60–1,40Ч109 /мл і кількістю живих 60–80%, що забезпечують виживання сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (+46,5°C) 72,7–126,5 хв, розморожених (+38°С) 312,0–373,9 хв, резистентність, відповідно, 22,5–44,5 і 11,3–32,4 тис.
4. Окисне навантаження” в еякулятах бугаїв зменшує використання кисню сперміями та відновну активність, підвищує чутливість ланок дихального ланцюга до нгібіторів. Відновлена форма глутатіону нівелює вплив т-БГП на окисно-відновн процеси у сперміях, стимулює їх інтенсивність при окисненні ендо- та екзогенних субстратів, забезпечує захист від факторів зовнішнього середовища та зберіга метаболічну активність енергогенеруючих ланок. Аскорбінова кислота, стимулю транспорт електронів у дихальному ланцюзі і окисні процеси не пов’язані з синтезом АТФ. Аскорбінова кислота чи відновлена форма глутатіону, додані по 2,50 мМ або у поєднанні (аскорбінова кислота : відновлена форма глутатіону) 1,25+2,50 мМ до свіжоотриманої розбавленої сперми, забезпечують у процесі інкубування за температури + 46,5°С показники виживання сперміїв 77,1–94,3 хв та збереженості 33,2–48,7%. Аскорбінова кислота та відновлена форма глутатіону 0,35:2,5 мМ додані до розріджувача сперми, підвищують запліднювальну здатність сперміїв.
5. Інкубування сперміїв, отриманих із придатка сім'яника, у середовищі з гомогенатом слизово матки корови, фолікулярною рідиною, гепарином забезпечує максимальну кількість їх з морфологічними та біохімічними показниками, характерними для акросомно реакції та капацитації: втрачається розділення між акросомою та головкою, інтенсивно поглинають кисень та зростають нтенсивність мітохондріального та немітохондріального дихання, відновна здатність, підвищується активність Г-6-ФДГ, СДГ (активних сперміїв). Значн коливання величин досліджуваних показників у зв’язку з факторами капацитац свідчать про відмінності сперміїв до дозрівання in vitrо і різну запліднювальну здатність.
6. У процес нкубування сперми та капацитації сперміїв знижується вміст альбуміну на 2,6–23,7% і a-глобулінів на 5,9%, підвищується – g-глобулінових фракцій на 0,5–15,3%. Зміни білкового спектру свіжоотриманої інкубованої сперми залежать від величин показників якості еякулятів і активності СДГ. Для капацитованих сперміїв характерне зростання вмісту білків з ММ 14,4, 30,0, 67,0 і більше 94,0 кДa та зменшення – 20,1 і 94,0 кДa. У збережених пробах (сперміях супернатанті) знижується вміст білків у зонах ММ від 30,0 до 45,0 та від 67,0 до 94,0 кДa і підвищується – від 45,0 до 67,0 кДa.
