Реферат: Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності

Вплив антиоксидантів на окисно-відновні процеси в еякулятах, вивчали у ФСБ при додаванні глутатіону (відновлена форма, Г-SH; 3Ч10-3М) аскорбінової кислоти (АА; 5Ч10-3М) та моделюванні ”окисного навантаження” (т- бутилгідроперекис; т-БГП, 10-3М) за наявност субстратів: фруктози, пірувату, б-КГ, сукцинату лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача сперми (ЛЖГ-cредовище) на дихальну та відновну активності сперміїв без- та з використанням інгібіторів. Вплив Г-SH і АА вивчали в еякуляті розділеному на частини контрольну (ЛЖГ- cередовище) і дослідн ЛЖГ-cередовище з додаванням: АА (2,50; 5,0; 10,0 мМ); Г-SH (2,50; 5,0; 10,0 мМ) та поєднання АА+Г-SH (1,25+1,25; 1,25+2,5; 2,50+2,50; 5,0+5,0 та 10,0+10,0 мМ). Досліджували у свіжоотриманій і розмороженій сперм нтенсивність поглинання кисню і відновну здатність, активність СДГ і ЦХО, вміст малонового діальдигіду (МДА; Tappel A. L., Zalkin H., 1959), рухливість, виживання резистентність статевих клітин. Для штучного осіменіння корів використовували сперму бугаїв Контакта 1375 і Ринка 2919. Кожен еякулят розділяли на дв частини, контрольну (без антиоксидантів) і дослідну (з антиоксидантами). Ефективність доданих антиоксидантів у розріджувачі визначали обліком результатів штучного осіменіння корів-аналогів.

Відбір яєчників корів за ооцитпродуктивністю, вивчення окисних процесів у фолікулах та ооцитах проводили після оцінювання їх фізіологічного стану: “фолікулярного зростання”, без жовтого тіла; зі ”свіжою” овуляцією, на місці фолікула утворена порожнина, жовте тіло відсутнє або діаметром до 0,5см, червоного кольору; з “раннім жовтим тілом, діаметром 1,0–2,0см, червоного або брунатного кольору; з “пізнім” жовтим тілом, діаметром 0,5–1,5см, жовтого кольору. Для досліджень використовували яєчники корів з фолікулами діаметром до 4мм (малі), 4–7мм (середні) і більше 7мм (великі).

Антральну рідину (фолікулярна рідина + клітини гранульозного шару фолікулів + ооцити), отримували методом аспірації фолікулів. У ній визначали кількість клітин гранульозного шару – підрахунком в камер Горяєва (106 клітин/мл) та ооцитів оцінювали стан кумулюсу (без кумулюсу – “голі”; з розпушеним або частково втраченим; з компактним багатошаровим) і поміщали в чашки Петрі з середовищем культивування. В антральній рідині фолікулів вивчали активність Г-6-ФДГ, вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення її і глутатіону (мг%; Чулкова М. С., 1955). Для вивчення локалізац антиоксидантів антральну рідину ділили на частини – в одній визначали їх вміст, ншу центрифугували при 600 g 15 хв, супернатант відділяли, а осад суспендували в адекватному об’ємі 0,9 %-ного натрію хлориду. Процедуру повторювали двічі. Антиоксиданти визначали у супернатанті (фолікулярній рідині) та суспендованому осаді (клітинах гранульозного шару фолікулів). Крім цього, у фолікулярній рідині вивчали вміст загального білка (г%) біуретовою реакцією, фракції білків елекрофорезом в 7,5% ПААГ (%) та глікопротеїнів (%; реактивом Шиффа). Клітини гранульозного шару фолікулів суспендували в середовищі RPMI-1640 (Flow Laboratories) і вивчали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/0,1мл суспензії клітин (СК)/хв); відновну активність (мкг К3…/мл СК/хв) без- та з інгібіторами. НАДН-редуктазн процеси стимулювали НАДН (10-3М), вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10-4М).

Для дозрівання ооцити інкубували в чашках Петрі з середовищами культивування клітин: ТС 199, Іґла (Sigma), RPMI-1640. До середовищ додавали: 10% фолікулярної рідини (не нактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см), 10% фетальної сироватки, 10% еструсної сироватки крові корів, клітини гранульози (5–7Ч106/мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Ооцити культивували в герметично закритому ексикаторі 16–18 год за максимальної вологості, вмісту СО2 5,0% і температури 38,5°С, рН середовища 7,2–7,4.

Запліднювали ооцити in vitro сперміями з придатка сім’яника, після капацитації у фолікулярній рідині (0,1мл СС; 12,0–15,0Ч106 /мл з активним прямолінійним рухом), які вносили в чашки Петрі до ооцитів проінкубованих 16–18 год.

Для вивчення нтенсивності окисних процесів у ембріонах, після 16–18 год спільного культивування ооцитів зі сперміями, ембріони переносили в середовища культивування: ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які додатково містили 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогів матки корів. Культивували в герметично закритому ексикаторі при максимальній вологості, температурі 38,5°С, 5% СО2. Середовище замінювали через кожні 48 год культивування.

У свіжоотриманих і збережених (24 год) ооцитах, визначали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/ооцит/хв) та відновну активність (пкг К3.../ооцит/хв) при використанні субстратів ендогенних (ФСБ Дюльбеко) і екзогенних: сукцинату (10-2М), АТФ (5Ч10-6М), середовищ культивування клітин (ТС 199, Іґла, RPMI-1640). Для виявлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню за наявност ендо- та екзогенних субстратів використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10-3М); НАДН-залежної ділянки дихального ланцюга (амітал; 5Ч10-3М); термінальної (NaN3; 5Ч10-2М); вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10-4М).

У ембріонів різних стадій розвитку визначали дихальну відновну активність у середовищах – ФСБ Дюльбеко і RPMI-1640. Для встановлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10-3М); НАДН-залежно (амітал; 5Ч10-3М) та термінальної (натрію азид; 5Ч10-2М) ділянок дихального ланцюга, вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10-4М).

Матеріал документували мікрофотографіями. Статистичний аналіз отриманих результатів проведено за Плохінським М. О. (1969) з використанням комп’ютера та розроблених програм (програмне забезпечення Clipper).

Результати Власних досліджень та їх аналіз

Інтенсивність окисно-відновних процесів у спермі бугаїв

Сперма бугаїв характеризується високою інтенсивністю окисно-відновних процесів. Так, дихальна активність сперміїв становить 17,8±0,55 нг-атом О/108сперміїв/хв, швидкість відновлення калію фериціаніду – 8,6±0,97 мкг К3…/108сперміїв/хв, активність СДГ – 11,2±0,21 і ЦХО – 33,1±0,37 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти – 37,3±3,51 мкг/мл, окиснених продуктів – 10,7±1,08 мкг/мл, загальний вміст 47,7±3,31 мкг/мл; відношення окремих складових до загального вмісту, відповідно, 78,2 : 22,4 (табл. 1). Вміст альбуміну 16,9±1,00%, глобулінів: a- 30,6±2,17%, b- 15,7±0,93%, g- 30,6±1,55%. При високих середніх значеннях, встановлено значні коливання величин досліджених біохімічних показників. Так, коефіцієнт варіації споживання кисню аскорбінової кислоти та їх компонент становить більше 50%, активності ферментів від 30 до 50%, відновної здатності – 20,9%.

Таблиця 1

Характеристика біохімічних показників еякулятів бугаїв

Фактори впливу на інтенсивність окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв

Мінливість наведених показників зумовлена зрілістю сперміїв в еякуляті, ндивідуальними особливостями плідників, що залежить від генетичних факторів, відмінністю першого і другого еякулятів, отриманих у той самий день та різні. Спермії отримані з придатка сім’яника, порівняно з еякульованими, характеризуються нижчими значеннями споживання кисню на 73,2% та відновно здатності на 95,0%. Від загальної кількості спожитого кисню аеробний гліколіз займає у сперміях з придатка сім’яника 16,7%, еякульованих 48,1%, активність НАД-залежної ланки дихального ланцюга, відповідно, 41,6% і 34,0% та термінальної (ЦХО) у перших не змінюється, других – 8,0%.

За дихальною активністю різниця між першим і другим еякулятами становить 42,8%, її мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, відповідно, 71,5 і 24,6%, активністю СДГ і ЦХО – 82,0 і 77,8%, вмістом аскорбінової кислоти 66,7%, продуктами окиснення не відрізняються, а за загальним вмістом – 40,0%. За фізіологічними показниками еякуляту різниця становить: об’ємом – 33,4%, концентрацією та кількістю живих сперміїв, відповідно, 44,5 та 19,1%.

При дослідженні сперми бугаїв у різні дні найбільша різниця виявлена за активністю СДГ та вмістом аскорбінової кислоти – 100,0%, споживанням кисню, в тому числі, мітохондріальним та азидрезистентним – 58,6–61,0%, окисненими продуктами аскорбінової кислоти та активністю ЦХО – 50%. Коливання фізіологічних показників становлять: об’єму еякуляту 15,3–25,0%, концентрації сперміїв 25,0–80,0%, кількост живих 8,0–27,1%.

Різниця за індивідуальними особливостями бугаїв становить: споживання кисню сперміями у еякулят 42,0%, його мітохондріальною і азидрезистентною компонентами, відповідно, 38,7 46,0%, активності СДГ та ЦХО – 12,5 та 8,1%, вмісту аскорбінової кислоти – 67,8% (р<0,01), окиснених продуктів – 50,9% (р<0,05). За фізіологічними показниками еякулятів, а саме, об’ємом на 22,4%, концентрацією сперміїв – 7,8%, кількістю живих 4,7%.

Біохімічні показники сперми змінюються в залежності від сезону року і, навесні проявляються низькі значення споживання кисню (нг-атом О/108 сперміїв/хв) 16,3±0,81, мітохондріального азидрезистентного дихання – 7,6±0,48 8,7±0,46, активності СДГ 10,8±0,41, ЦХО 31,6±0,76 мкМ/хв/л. Влітку величини значень досліджуваних показників залишаються майже на тому ж рівні. Винятком мітохондріальне дихання та активність СДГ, які збільшуються, відповідно, на 30,2% (р<0,05) та 9,2%. Восени підвищується споживання кисню спермою на 87,7% (р<0,001), в тому числі, мітохондріальне на 10,1% (р<0,001), азидрезистентне у 2,4 рази (р<0,001), активність ЦХО на 14,7% (р<0,001). Активність СДГ, порівняно з літнім періодом, не змінюється і становить 11,5±0,36 мкМ/хв/л. Взимку значення показників знижується, порівняно з осіннім періодом: споживання кисню спермою на 17,2% (р<0,01), азидрезистентне дихання на 28,1% (р<0,001), активність СДГ на 2,7%, ЦХО на 6,2% (р<0,05). Мітохондріальне дихання не змінюється і становить 11,0±0,76 нг-атом О/108сперміїв. Вміст аскорбінової кислоти взимку і навесні майже однаковий (37,0 мкг/мл), влітку знижується на 21,4%, а восени знову підвищується до 53,7±4,59 мкг/мл (на 84,5%). Вміст дегідроаскорбіново дикетогулонової кислот, низький взимку (11,2±1,04 мкг/мл), навесні і влітку збільшується на 13,4 і 26,8% (р<0,001), а восени досягає максимального значення – 20,9±1,11 мкг/мл. При цьому, відношення окремих складових у загальному вмісті аскорбінової кислоти свідчить про зниження частки аскорбінової кислоти від початку весни до літа на 5,0% і зростання окиснених продуктів на 12,5% (р<0,05). Влітку вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот зменшується на 10,5%, а аскорбінової кислоти підвищується на 3,8%. Восени відношення аскорбінова кислота : окиснені продукти у загальному вміст становить 71,9±2,43 : 28,1±2,44% і майже таке ж взимку (77,1±3,75:22,9±3,72%). Із фізіологічних показників еякуляту з сезоном року змінюється об’єм, з низького восени (3,4±0,21мл), взимку підвищується на 24,5% (р<0,001) навесні досягає максимального значення (5,0±0,16мл). Влітку величина показника знижується на 20,0% (р<0,001), порівняно із весняним періодом, проте вища, ніж восени на 15,0% (р<0,05). Концентрація сперміїв максимальна в осінній період (1,05±0,03Ч109/мл), зимою знижується на 8,6%, а весною і влітку – в межах 0,88–0,89Ч109/мл. Кількість живих сперміїв в еякуляті низька весною (65,9±0,81%), влітку збільшується на 7,1% (р<0,001), а восени та взимку поступово знижується, відповідно, на 3,0 та 3,7%.

Вказан біохімічні показники змінюються з віком бугаїв. Зокрема, у спермі 2–3-річних плідників інтенсивність споживання кисню становить 26,5±4,70 нг-атом О/108 сперміїв/хв, зі збільшенням віку до 5 років підвищується на 4,1% і у 6–9 річних залишається майже на тому ж рівні (27,0±3,35 нг-атом О/108 сперміїв/хв). Частка кисню реалізована мітохондріями сперміїв у 2–3 річних бугаїв становить 10,8±2,75 нг-атом О/108/хв, у 4–5-річних збільшується на 32,4%, старших 6-ти річного віку знову знижується на 27,7%. Азидрезистентне дихання у спермі плідників 4–5 років низьке (13,1±0,99 нг-атом О/108/хв), у 2–3 та 6–9-річних вище, відповідно, на 19,8 та 27,4%.

Отже, у загальному об’ємі кисню утилізованого сперміями 2–3 річних бугаїв переважають немітохондріальні процеси (відношення до загально кількості спожитого кисню мітохондріальної і немітохондріальної компонент 40,7:59,2), у 4–5 річних зроста мітохондріальна компонента дихання (51,8:47,5), а у спермі плідників 6–9 річного віку підвищується немітохондріальна (41,4:61,8).

Активність ферментів у спермі бугаїв від 2-х до 6 років майже не змінюється (СДГ 9,4–10,6 ЦХО 30,5–32,3 мкМ/хв/л), у 6–9-річному віці зростає, відповідно, на 65,9 26,2% (р<0,001). Вміст аскорбінової кислоти характерний високим значенням (40,6±3,79 мкг/мл) в еякулятах бугаїв у віці 4–5 років, у 2–3 та 6–9-річних нижчий на 11,2–13,1%. Вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот у спермі молодих бугаїв (2–3 роки) високий (12,5±1,53 мкг/мл), у 4–5 річних знижується на 14,6% (10,9±1,38 мкг/мл) і в 6–9 річних 7,3±1,06 мкг/мл що, нижче попереднього на 33,1% (р<0,05) і вихідного на 41,6% (р<0,01). Аналіз результатів свідчить про вірогідне (р<0,01) підвищення частки аскорбінової кислоти з 74,4% в еякулятах 2–3 річних плідників до 84,3% у 6–9 річних. Вміст продуктів окиснення вірогідно (р<0,01) знижується з 27,3% у 2–3 річному віці до 17,2% у 6–9-річних. Вікова динаміка фізіологічних показників еякулятів характерна низьким об’ємом (3,1±0,15 мл) у 2–3-річних бугаїв, але високим значенням концентрації та кількості живих сперміїв, відповідно, 0,97±0,05Ч109/мл та 70,7±1,22%. Зі збільшенням віку до 5 років об’єм еякуляту підвищується на 45,1% (р<0,001), концентрація сперміїв на 10,3%, а кількість живих знижується на 3,5% (р<0,05). У 6–9 річних бугаїв об’єм еякуляту ще підвищується на 15,5%, а концентрація і кількість живих сперміїв зменшуються, відповідно, на 14,7% і 1,6%.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7