Курсовая работа: Культуры изолированных клеток и тканей как новый источник для получения лекарственного сырья

Для экспериментальной проверки правильности этой гипотезы были введены в культуру каллусные ткани от гипокотиля и корня проростка гармалы, полученного из семян египетского происхождения. Ткани выращивали на агаризованной среде Мурасиге и Скуга с добавлением 2,4-Д (1 мг/л) и кинетина (1 мг/л). несмотря на то, что каллусные ткани были получены от частей ювенильного растения, они имели некоторые морфологические различия, которые сохранялись в течение четырёхлетнего культивирования: гипокотильная ткань была более плотной и отличалась от корневой ткани своей кремовой окраской, причём в ряде случаев на отдельных участках ткани была заметна яркая красная пигментация. Общим свойством тканей была их относительная гомогенность и отсутствие визуальных признаков дифференциации.

В каллусных тканях гармалы первых пассажей было обнаружено присутствие веществ, имеющих голубую и ярко-жёлтую флуоресценции. При экстрагировании лиофилизированных тканей метанолом и последующем хроматографировании концентрированных экстрактов в тонком слое силикагеля в системе хлороформ : метанол : аммиак (10 : 4 : 1) было показано присутствие в тканях четырёх b-карболиновых алкалоидов гармина, гармалина, гармола и гармалола, типичных для корней целого растения. Идентификация алкалоидов в каллусных тканях проводилась путём хроматографирования экстрактов с аутентичными образцами алкалоидов в различных системах растворителей и сопоставления спектров поглощения и спектров флуоресценции обнаруженных веществ с соответствующими спектрами чистых алкалоидов.

По своему качественному составу гипокотильная и корневая ткани не различались. Доминирующими алкалоидами в обеих тканях были гармин и гармалол, количественное содержание которых определяли по поглощению в УФ-свете (гармин – при 245 нм, гармалол – при 390 нм).

В условиях оптимального, но недифференцированного роста содержание гармина в каллусных тканях было почти в 500 раз, а гармалола – 20 раз ниже, чем в исходном растении. Концентрация гармина и гармалола была выше в гипокотильной ткани, однако с пассированием эта разница практически нивелировалась, а общее содержание алкалоидов резко снижалось.

Изменение содержания индольных алкалоидов (мкг/г сухой ткани) в каллусных тканях гармалы при культивировании
Номер пассажа	Корневая ткань		Гипокотильная ткань
	Гармин	Гармалол	Гармин	Гармалол
5	62,2	89,2	174,1	129,7
7	45,2	11,4	50,2	40,5

С целью регуляции степени дифференциации каллусных тканей гармалы и соответственно образования в них алкалоидов в питательную среду вместо 2,4-Д вводили индолилмасляную кислоту (ИМК) (2 мг/л), а также в ряде случаев произвели замену кинетина на бензиламинопурин (1 мг/л). изменение гормонального состава питательной среды вызывает снижение ростовой активности тканей, увеличение их плотности и проявление в них признаков корневой дифференциации. Длительное субкультивирование тканей на среде, содержащей ИМК, приводило к появлению некрозов у корневой ткани и к прекращению её роста. Гипокотильная ткань сохраняла ростовую активность, однако она была значительно ниже, чем у ткани, растущей на 2,4-Д.

Химический состав каллусных тканей гармалы при перенесении их на среду, содержащую ИМК, показал, что концентрация b-карболиновых алкалоидов в них резко увеличилась. Однако, снижение ростовой активности тканей при проявлении корневой дифференциации не компенсировалась увеличением концентрации алкалоидов, и общая продуктивность тканей при этом практически не увеличилась.

Влияние сочетания различных гормонов на содержание индольных алкалоидов в каллусных тканях гармалы (мкг/г сухой ткани)
Сочетание экзогенных гормонов	Номер пассажа	Корневая ткань		Гипокотильная ткань
		Гармин	Гармалол	Гармин	Гармалол
2,4-Д+кинетин	5	62,2	89,2	174,1	129,7
ИМК+кинетин	11	308,1	621,6	212,1	240,0
ИМК+БАП	11	161,1	200,0	262,2	439,2

Ненадёжность изменения состава экзогенных гормонов и нестабильность роста каллусных тканей гармалы при таком способе регуляции их дифференциации и биосинтеза индольных алкалоидов заставили обратиться к генетической трансформации клеток гармалы с помощью Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes. Для этого использовали дикий штамм А-4, суспензией клеток которого было проведено инфицирование пораненных участков гипокотиля стерильного проростка гармалы.

Через 3 – 4 недели после заражения на месте поранения и инфицирования можно было увидеть образование хорошо растущих адвентивных корней. При вычленении этого участка гипокотиля и его переносе на питательную среду, содержащую антибиотики (клафоран, 500 мг/л), после двух субкультивирований удавалось добиться элиминирования бактерий. Последующее отделение корней и перенесение их на безгормональную питательную среду привело к получению интенсивно растущей ризогенной культуры, которую принято называть культурой «бородатых корней» (“hairy root culture”). О том, что это генетически изменённая культура, свидетельствовал характер образования и роста корней, независимость их роста от экзогенных гормонов и содержание в культуре маннопина.

Ризогенная культура гармалы хорошо росла в жидкой питательной среде при условии её небольшого объёма и постоянного перемешивания. Полное погружение корней в питательную среду и статика не обеспечивали достаточной для роста аэрации культуры. Наилучший рост ризогенной культуры наблюдался на подложках (вискоза и бумажный фильтр), смоченных избытком питательной среды. При таком способе выращивания трёхнедельная культура гармалы достигала 20-кратного увеличения массы.

Генетически трансформированная ризогенная культура гармалы наряду с проявлением корневой дифференциации восстанавливала и способность к биогенезу индольных алкалоидов. Просмотр культур в УФ-свете показывал интенсивную флуоресценцию корней, типичную для гармина и гармалола. Хроматоспектрометрический анализ метанольных экстрактов из ризогенной культуры показал, что она по количественному и качественному составу алкалоидов мало отличается от корней ювенильных растений гармалы. Если при максимальном содержании b-карболиновых алкалоидов в неорганизованно растущих тканях концентрация гармина в них была более чем в 100 раз, а гармалола – в 5 раз ниже концентрации этих алкалоидов в корнях проростка, то в трёхнедельной ризогенной культуре 12-го пассажа концентрация гармина составляла 1/3 от концентрации алкалоида в корнях проростка, а концентрация гармалола превышала концентрацию алкалоида в корнях. При этом восстанавливалось и типичное для корней целого растения преобладание гармина над гармалолом.

Содержание алкалоидов в ризогенной культуре гармалы (мг/г сухой массы корней)
Пассаж культуры	Гармин	Гармалол
12-й пассаж (3-недельная культура)	12,85	2,46
12-й пассаж (5-недельная культура)	19,90	2,01
Корни проростков	50,66	2,16
Стебель проростков	10,85	1,84

Если принять во внимание интенсивность роста ризогенной культуры (20-кратное увеличение массы) и непрерывность её выращивания, то можно увидеть, что продуктивность такой культуры значительно превышает продуктивность ювенильных растений гармалы.

Таким образом, генетически трансформированная культура гармалы, наделённая способностью к синтезу гормонов, обеспечивающих появление корневой дифференциации, характеризуется высоким уровнем содержания b-карболиновых алкалоидов, который вполне сравним с уровнем биосинтеза этих алкалоидов в органах целого растения. Чётко установленная зависимость между корневой дифференциацией и уровнем синтеза b-карболиновых алкалоидов подтверждает правильность гипотезы о локализации образования этих индольных алкалоидов в корнях гармалы. В этом отношении ризогенная культура гармалы наряду с аналогичными культурами белладонны, дурмана, белены и других паслёновых служит примером корнеспецифичности биосинтеза определённых групп алкалоидов.

Результаты, полученные с трансформированной культурой гармалы, показывают возможность и эффективность использования приёмов генетической инженерии не только на растениях семейства паслёновых, но и на растениях других семейств, в которых образование алкалоидов или других вторичных веществ локализовано в корневой системе. Индукция биосинтеза вторичных веществ в таких генетически изменённых культурах может служить реальной основой для получения искусственно выращиваемых растительных систем, продуцирующих те же ценные биологические вещества и на том же количественном уровне, что и целое растение.

3.3 Накопление алкалоидов в культуре ткани раувольфии змеиной

Культура ткани раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina) является перспективным источником аймалина – алкалоида группы индолина, обладающего противоаритмическим действием. Аймалин содержится в смеси алкалоидов биомассы в количестве 30-40%. 40-50% составляет вомиленин индолениновый алкалоид, который рассматривается как биогенетический предшественник аймалина. Превращение вомиленина в аймалин под действием ферментов, выделенных из клеток раувольфии, в настоящее время осуществлено in vitro и включает в себя гидрирование вомиленина и его метилирование. Источником пиридиннуклеотидов является витамин РР (никотиновая кислота и никотинамид). Перенос метильных групп осуществляется с помощью серосодержащих аминокислот метионина и ацетилметионина.

Целью настоящей работы было выяснение влияния витамина РР, серосодержащих аминокислот, вомиленина (как предшественника аймалина) и сульфат-иона на накопление алкалоидов, в частности, аймалина в стеблевой культуре ткани раувольфии (клеточная линия А). В качестве контроля использовали регламентную питательную среду (Р). В опытных вариантах в неё вносили 2 или 5 мг/л никотиновой кислоты (среды Н2 и Н5), 10 мг/л метионина или ацетилметионина (среды М и АМ), 1 мг/л вомиленина (среда В). Вомиленин добавляли после автоклавирования среды в асептических условиях, остальные добавки вносили до автоклавирования. Среды S1 и S2 были обеднены неорганической серой: в S1 не вносили сульфат аммония; в S2, кроме того, в 5 раз уменьшили содержание сульфата магния. Опыты проводили на трёх пассажах в десятикратной повторности. После культивирования в течение 70-75 суток при 26±20 биомассу высушивали. В ней титриметрически определяли сумму алкалоидов, фотоколориметрическим методом – аймалин, хроматоспектрофотометрическом – вомиленин.

Результаты опытов приведены в таблице. Они показывают, что добавление к среде никотиновой кислоты не влияло на содержание алкалоидов в биомассе. Снижение содержания в среде сульфат-иона привело к уменьшению количества суммы алкалоидов, аймалина – в 1,5 раза, и к возрастанию (приблизительно в 2 раза) содержания в биомассе вомиленина. При введении в среду серосодержащих аминокислот в 1,2 раза увеличилось общее содержание алкалоидов в биомассе, а содержание аймалина возросло в 2 раза. Добавление вомиленина вызвало накопление в биомассе аймалина при сохранении контрольного уровня содержания суммы алкалоидов. Это вполне согласуется с литературными данными о превращении вомиленина в аймалин.

Накопление алкалоидов в биомассе в зависимости от состава среды
Количество биомассы или алкалоидов	Питательная среда
	Р	Н2	Н5	S1	S2	М	АМ	В
Биомасса, г/1л среды	29,0±2,5	27,5±3,3	27,8±4,6	24,6±3,0	27,3±3,8	24,0±2,0	25,6±2,7	25,3±2,7
Сумма алкалоидов
Мг/1л среды	472±31	490±49	506±36	310±32	314±24	463±45	440±38	416±13
% к воздушно-сухой массе	1,63±0,11	1,78±0,18	1,82±0,13	1,26±0,13	1,15±0,09	1,93±0,19	1,72±0,15	1,64±0,05
Аймалин
Мг/1л среды	130±7	115±22	111±19	59±7	82±10	276±23	307±32	207±45
% к воздушно-сухой массе	0,45±0,05	0,42±0,08	0,40±0,07	0,24±0,05	0,30±0,03	1,15±0,12	1,20±0,07	0,82±0,18
% к сумме алкалоидов	28,8	23,6	22,1	19,0	26,1	59,2	69,8	50,0
Вомиленин
Мг/1л среды	116±15	82±1	86±4	150±17	142±19	115±12	128±3	96±10
% к воздушно-сухой массе	0,40±0,05	0,30±0,02	0,31±0,03	0,61±0,07	0,52±0,07	0,48±0,05	0,50±0,01	0,38±0,04
% к сумме алкалоидов	24,5	17,0	17,0	48,4	45,2	24,8	29,0	23,1

Результаты исследования свидетельствуют о том, что накопление алкалоидов в биомассе связано с содержанием в среде как неорганической серы, так и серосодержащих аминокислот. Для получения обогащенной аймалином биомассы целесообразно добавлять к питательной среде метионин и ацетилметионин.

3.4 Алкалоиды каллусных тканей мака прицветникового

Мак прицветниковый (Papaver bracteatum) может быть использован c целью получения тебаина – морфинового алкалоида, являющегося предшественником кодеина и морфина. Тебаин составляет до 98% от суммы алкалоидов P.bracteatum и в лабораторных условиях легко может быть переведён в кодеин наиболее широко распространённое в мире противокашлевое средство.

Литературные данные свидетельствуют о том, что в культуре клеток растений рода Papaver доминируют алкалоиды протопионового, бензафенантридинового и тетрагидропротоберберинового типов, берущих начало от (+)-ретикулина и отсутствуют, либо присутствуют в следовых количествах алкалоиды морфинановой группы, характерные для растений это рода. При повышении уровня дифференцировки может проявляться тенденция к восстановлению спектра алкалоидов, характерного для целого растения.

Целью настоящей работы являлось получение каллусных тканей P.bracteatum, регенерантов из них и сравнение спектров алкалоидов в культуре тканей и в онтогенезе целых растений.

Штамм Р11 был способен к регенерации при культивировании по следующей схеме: каллусная ткань, выращиваемая в темноте, пересаживалась на среду, отличающуюся от исходной отсутствием гормонов, и выдерживалась в течение 30 дней в темноте. При этом в примыкающем к среде слое каллуса образовывались очаги дифференциации, которые затем пересаживали на свежую питательную среду того же состава и выставляли на свет. Через 2-3 недели внутри и на поверхности каллуса наблюдалось появление зачатков зелёных листочков, иногда образовывались корни. По мере формирования листочков регенеранты высаживали на среду Стрита для активации образования корней. При достижении корнями длины 5-10 мм регенеранты высаживали в вазоны со стерильной почвой и переносили в теплицу.

Присутствие в растительных образцах сангвинарина или тебаина определялось с помощью хроматографии хлороформного экстракта лиофилизированной ткани в тонком слое силикагеля, содержащего и не содержащего люминесцентную добавку, для раздельного определение флуоресцирующих и поглощающих зон.

Количественное определение сангвинарина в культуре тканей рассчитывали по экстинкции при 340 нм вытяжки 10%-ной H2SO4 из хлороформного экстракта лиофилизированной ткани. О количестве алкалоида, переходящего в сангвинарин, судили по разности в содержании сангвинарина в подкисленном муравьиной кислотой хлороформном экстракте до и после облучения его светом лампы ДРШ-250 в течение 1 минуты.

От различных частей двулетних растений мака прицветникового кавказской популяции и популяции Arya 11 были получены каллусные ткани. При качественном изучении спектра алкалоидов в каллусных культурах тебаин обнаружен не был, в то время как в тканях всех штаммов присутствовал сангвинарин, не характерный для целого растения. Содержание сангвинарина в тканях колебалось от 0,5 до 1,7%, а в штамме, полученном из цветоноса растения популяции Arya 11, оно составляло 2,7±0,4%. Наряду с сангвинарином в тканях был обнаружен алкалоид, который на свету переходил в сангвинарин. Содержание его в каллусных тканях по отношению к общему содержанию сангвинарина составляло от 11 до 40%.

Изучение спектров целых растений показало, что они способны к синтезу не только тебаина, но и сангвинарина. Тебаин присутствовал во всех частях растений на протяжении всего времени наблюдения за ними, в то время как сангвинарин был обнаружен в листьях растений только первого года жизни, при чём содержание его с возрастом снижалось. В растениях, выращенных в естественных условиях, в пределах своего ареала, сангвинарин обнаружен не был, и биосинтез его является, по-видимому, явлением, не характерным для сформировавшихся растений.

Из этого факта, что растения мака прицветникового способны в определённых условиях продуцировать сангвинарин, следует, что проявление способности к его биосинтезу в культуре тканей данного растения не является случайным. Исследование спектра алкалоидов регенерантов, полученных из каллусной культуры штамма Р11, показало, что они были способны к биосинтезу сангвинарина, а тебаин был обнаружен в листьях растений-регенерантов лишь спустя 5 месяцев после выращивания их теплице.

Таким образом, способность к биосинтезу алкалоидов тебаина и сангвинарина позволяет выделить две противоположные ситуации: культура тканей способна к биосинтезу только сангвинарина, а выращиваемые в природных условиях растения – к биосинтезу одного тебаина. Кроме того, имеются и промежуточные переходные положения, когда биосинтез обоих алкалоидов одновременно идёт в растениях-регенерантах и в ювенильных растениях.

По-видимому, биосинтез сангвинарина связан с ювенильной стадией развития растения и его появление в системе с низким уровнем дифференцировки является, следовательно, закономерным для растений рода Papaver.

3.5 Образование вторичных метаболитов в культуре тканей растений семейства Rutaceae

Многие растения семейства рутовых известны как продуценты физиологически активных соединений. Интерес к этому семейству особенно возрос после обнаружения у некоторых метаболитов Rutaceae противоопухолевой активности. Лечебные свойства руты обыкновенной и близкого, но менее известного вида Boenninghausenia albiflora обусловлены наличием в них кумаринов, фурохиналиновых и акридоновых алкалоидов. Спектры кумаринов и алкалоидов обоих видов в значительной мере подобны, однако в B.albiflora обнаружен неизвестный до сих пор для Ruta акридоновый алкалоид норакроницин, который легко преобразуется in vitro в акроницин, обладающий широким спектром противоопухолевой активности.

Из стерильных проростков семян B.albiflora были получены каллусные культуры, которые проявили различные морфологические признаки при выращивании на среде Мурасиге и Скуга. При длительных пересевах были отобраны штаммы: В1 –гомогенная ткань, В2 –ткань с ризогенезом и В3 –ткань с элементами стеблевого органогенеза.

Для изучения состава вторичных метаболитов, синтезируемых в клетках B.albiflora in vitro, лиофилизированные ткани В1, В2 и В3 экстрагировали метанолом.

Предварительная тонкослойная хроматография (ТСХ) метанольных экстрактов показало наличие множества зон с флуоресценцией, типичной для кумаринов. Из суммы метанол-растворимых веществ были выделены фракции органических кислот, фенольных соединений и лактонов, мешающих обнаружению пренилированных акридонов (рутокредон, норакроницин).

Фракционирование метанольных экстрактов тканей В1, В2, В3

С помощью препаративной ТСХ из фракций выделяли индивидуальные соединения и затем идентифицировали их сравнением с чистыми веществами по хроматографическому поведению и УФ-спектром.

Анализ фракций лактонов показал наличие во всех трех штаммах (в качестве преобладающих компонентов) кумаринов: рутомарина, рутакультина, бергаптена, ксантотоксина, хелиеттина, дафноретина и умбеллиферона. Следует отметить, что кумариновый состав штаммов В1, В2, В3 в значительно большей мере соответствует составу В.japonica (наличие бергаптена, ксантотоксина, рутомарина, умбеллиферона и дафноретина), чем состава В.albiflora, в котором ранее были обнаружены лишь бергаптен, дафноретин, и следы рутомарина. Рутакультин и хелиеттин (дезацитилрутамарин) обнаружены в роде Boenninghusenia впервые.

Из остатков метанольных сумм, обогащенных липидными компонентами и имеющими характерный желтый цвет, были выделены и идентифицированы алкалоиды рутакридон и его водорастворимое производное глюкозит гравакридондиола. Норакроницин ни в одном из штаммов не был обнаружен.

Штаммы В1 и В3 (гомогенные не дифференцированная ткань и ткань с элементами стеблевого органогенеза) по составу кумаринов и пренилированных акридонов практически не различались, тогда как ткань с выраженным ризогенезом – штамм B2 – характеризовалась значительно большим рутакультина и рутакридона. Содержание рутакридона и глюкозида гравакридондиола, определено методами ТСХ и УФ-спектрометрии, составляло для штаммов В1 и В2 – следы и 0,01; 0,01 и 0,03% соответственно.

Известно, что в культурах клеток Rutaceae в большинстве случаев не теряется способность к синтезу вторичных метаболитов, но их концентрация бывает значительно ниже, чем в органах интактных растений. В некоторых случаях в культуре обнаруживается также изменение в спектре метаболитов, вплоть до появления веществ, не типичных для целого растения. Изменения в спектре вторичных метаболитов в культуре ткани и снижение их концентрации объясняется физиологическими особенностями растительных клеток, не достигающих в культуре in vitro уровня дифференциации, соответствующего уровню специализированных клеток целого растения.

Отсутствие в исследованных штаммах ткани В.albiflora норакроницина, возможно, объясняется именно низким уровнем организации культивируемых клеток. Взаимосвязь физиологической и биохимической дифференциации в культуре клеток В.albiflora доказывается так же тем, что при исследовании ее с помощью люминесцентного микроскопа ярко-оранжевая флуоресценция, характерная для акридоновых алкалоидов, была обнаружена только в резогенном штамме В2. Причем флуоресценция была локализована в корневых трихомах и в некоторых поверхностных клетках корней. Количественное определение акридоновых алкалоидов В1 и В2 также подтверждает это положение.

Таким образом, в штаммах тканях В.albiflora, не содержащих типичного для целого растения алкалоида норакроницина, обнаружены наряду с рутакридоном и глюкозидом гравакридондиола, кумарины и фурокумарины, характерные для растений рода Boenninghusenia, а также новые для рода кумарины рутакультин и хелиеттин. Количество акридоновых алкалоидов в штаммах зависит от уровня дифференциации ткани.

Заключение

В заключении хочется отметить, что эта тема является очень перспективной для фармацевтической промышленности, так как продуктивность культуры тканей можно регулировать, а значит количество необходимого соединения будет гарантировано. Кроме того культуры защищены от внешних неблагоприятных факторов, способных снизить качество сырья. Процесс сбора и обработки такого сырья значительно упрощается за счёт культивирования только нужной ткани растения в стерильных условиях. Проблемой является трудоёмкий процесс отбора необходимой ткани и разработки среды для получения оптимального результата. Работы которые представлены в данной курсовой – это лишь малая часть, которая не отображает всего масштаба этой темы.

Литература

1.         Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.

2.         Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. 286 с.

3.         Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. 280 с.

4.         Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения. М.: 1986. с.3-20.

5.         Воллосович А.Г.//Культура изолированных тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. с.234-235.

6.         Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения / М.Н. Запрометов и др. // Физиол. растений, 1986. T. 33. № 2. С. 356-364.

7.         Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. С. 37-50.

8.         Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro // Физиол. растений, 1999. Т. 46. № 6. С. 919-929.

9.         Лекарственное сырьё растительного и животного происхождения. Фармакогнозия: учебное пособие/ под ред. Г.П.Яковлева. СПб.: СпецЛит, 2006. 845 с.