Курсовая работа: Культуры изолированных клеток и тканей как новый источник для получения лекарственного сырья
Вторичный метаболизм культивируемых клеток привлекает вс больше внимания исследователей, это обусловлено, прежде всего перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. В медицине 25% всех применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве.
Как показал почти полувековой опыт исследования вторичных соединений в клеточных культурах растений (с 1940 года), для этого необходимо решение многих фундаментальных проблем биологии культивируемых клеток. Наиболее серьёзной из них является разработка стратегии контроля синтеза вторичных соединений в культивируемых клетках растений. До сих пор неясно, возможна ли разработка единой стратегии или она должна быть специфической для разных классов вторичных соединений, или же индивидуальной для каждого конкретного случая.
2.3 Влияние генетических, физических и химических факторов на рост и развитие культуры клеток и тканей, на синтез вторичных метаболитов
На культивирование клеток оказывают влияние многие факторы, такие как:
1.генетика экспланта (выбор вида растения, выбор конкретного растения донора)
2.эпигенетика экспланта (выбор органа растения)
3.генетика популяции клеток (культивирование (селекция) культуры, получение мутантов)
4.физиология популяции клеток (оптимизация условий (химических и физических факторов) роста и синтеза вторичных соединений)
А) Химические факторы.
Углеводное питание. Как показано в многочисленных работах, культуры могут расти на различных углеводах (испытано более 30 различных соединений). Как правило, лучший рост отмечается на двух сахарах глюкозе или сахарозе. В то же время высокий уровень синтеза свойственен культурам на сахарозе. На средах с глюкозой синтез часто сильно ослаблен. Причины этого явления не ясны.
Минеральное питание. Минеральный состав сред оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений, при этом наиболее важно содержание фосфора, калия и различных форм азота. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ухудшению синтеза вторичных метаболитов. Их синтез начинается обычно после исчерпания фосфора из среды. Высокие концентрации фосфора в среде снижают синтез никотина в культуре клеток табака, антоцианов в культивируемых клетках моркови, фенолов в клетках чая. В то же время имеются сообщения о повышении содержания вторичных соединений при повышенных концентрациях фосфора – алкалоидов в клетках барвинка розового, антрахинонов в культуре клеток Galium.
Показано, что как для роста, так и для синтеза вторичных соединений необходимы минеральные формы азота. Органические формы – пептон, дрожжевой экстракт и другие – тормозят и рост, и синтез. Очень важно соотношение аммонийного и нитратного азота. Можно проследить определенную тенденцию – повышение доли нитратного азота способствует увеличению синтеза вторичных веществ, в частности, диосгенина в культуре клеток диоскореи.
Фитогормоны. Эти компоненты среды привлекают наибольшее внимание исследователей. Однако влияние гормонов на синтез вторичных соединений в культуре клеток неоднозначно и может изменяться в зависимости от класса вторичных соединений, физиологического состояния культуры, условий культивирования и др. Наиболее интенсивно изучались ауксины и цитокинины, так как они, как правило, являются необходимыми компонентами сред. Имеется большое число примеров, когда ауксины стимулировали синтез вторичных соединений, и примерно столько же, когда подавляли. Ауксины стимулировали синтез антоцианов в культурах моркови и тополя, антрахинонов в Cassia fistula, Cassia torra, сапогенинов в тригонелле; уменьшали и исключали синтез антрахинонов и шиконина в воробейнике, скополамина - в белене, хлорогеновой кислоты – в табаке.
Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных соединений существенно меньше, что не позволяет уловить какие-либо закономерности. Результаты по другим классам других фитогормонов весьма фрагментарны и противоречивы.
РН среды. По влиянию рН среды на синтез вторичных соединений данных очень немного. Однако, по имеющимся сведениям, рН среды существенно влияет на этот процесс. Например, при изучении синтеза индола в культуре клеток ипомеи в условиях рН-стата оказалось, что при рН 6,3 синтез индола максимален и в два раза превышает уровень синтеза без рН-статирования. В рН-стате при уровне рН 4,8 синтез полностью прекращается.
Б) Физические факторы.
Аэрация. Очень важный фактор, но практических данных немного. Важно как значение расхода кислорода, так и соотношение СО2/О2. Высокое отношение О2/СО2 может ингибировать и рост и синтез вторичных продуктов.
Температура. Влияние температуры на синтез вторичных метаболитов изучалось лишь в нескольких работах. Показано, например, что оптимум синтеза никотина в клетках табака находится при 270, уклонение на 50 в любую сторону приводит к снижению синтеза более чем в 3 раза.
Свет. Этому фактору посвящено наибольшее число работ. При этом разбирается как полная индукция синтезов, так и влияние на количество соединений света разной интенсивности и качества.
Свет увеличивает содержание эпикатехинов и протоантоцианидов в культуре клеток чая, серпентина в барвинке, витамина В6 и суммы алкалоидов в дурмане и руте. Красный цвет увеличивает синтез подофиллотоксина в культивируемых клетках подофилла.
Достаточно часто освещение изменяет соотношение разных классов вторичных соединений. Например, в культуре клеток Tabernaemontana divaricata под действием света существенно изменялись соотношения аспидосперматановых, коринантиновых, плюмерановых и ибогановых алкалоидов.
В то же время часто свет выключает или снижает синтез вторичных соединений. Синтез гиосциамина и скополамина в культуре клеток дурмана происходит только в темноте, освещение снижает содержание алкалоидов в клетках культуры хинного дерева, шиконина – в культуре клеток воробейника. В последнем случае показано, что свет разрушает ФМН, необходимый для синтеза шиконина.
В) Генетические факторы.
Культуры клеток растений характеризуются большой степенью генетической гетерогенности клеток в популяции. При этом гетерогенность наблюдается на разных уровнях организации генома – на уровне точковых мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом и, наконец, цитоплазматических генов. В качестве основных причин гетерогенности выдвигаются:
А) гетерогенность исходных эксплантов
Б) мутационный эффект компонентов среды культивирования
В) эффект отсутствия организменного контроля («сита мейоза» и др.)
Эта гетерогенность клеточной популяции позволяет с помощью клонирования отбирать линии клеток с сильно изменёнными свойствами, в частности с повышенным синтезом вторичных метаболитов. Таким образом были отобраны штаммы – продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина. Однако судьба отобранных клонов при длительном культивировании различна: в одних случаях синтез вторичных метаболитов в клонах нестабилен и возвращается на уровень исходной культуры, в других случаях клон достаточно стабилен. Причины такого различия в поведении не ясны. Наконец, максимальные изменения генома культивируемых клеток могут быть получены в результате индуцированного мутагенеза. В полученных мутантных штаммах возможны резкие качественные и количественные изменения синтезов вторичных соединений.
3. Культура ткани растений и синтез вторичных метаболитов
3.1 Образование полифенолов в культуре ткани чайного растения
Фенольные соединения (ФС), или полифенолы, занимают одно из центральных мест среди вторичных соединений благодаря их всеобщему распространению в растениях и разнообразным функциям (защита при патогенезах, механических повреждениях и облучении, использование в качестве запасного энергетического материала и др.). Полифенолы имеют также важное биотехнологическое значение (использование в медицине, пищевой промышленности и некоторых других областях народного хозяйства).
В качестве объекта, позволяющего исследовать процессы регуляции образования ФС, была использована культура тканей чайного растения. Известно, что это растение обладает специализированным обменом веществ, направленным на синтез соединений дифенилпропановой структуры (катехина, галлокатехина, катехингаллата.ю галлокатехингаллата).
Каллусные культуры стебля чайного растения (Camellia sinensis L., грузинская разновидность) выращивали в темноте или при непрерывном освещении (3000 лк) при 260 и относительной влажности воздуха 70% на оптимальной питательной среде, содержащей 2,4-Д (2*10-5 М) и глюкозу (2,5%). Содержание суммы растворимых ФС, флаванов и лигнина определяли спектрофотометрическими методами с использованием реактива Фолина –Дениса, ванилинового реактива и 2,6-дихлорхинонхлоримида соответственно.
Гетеротрофная (выращиваемая в темноте ) каллусная культура чайного растения, как и большинство пролиферирующих клеток, обладает более низким биосинтетическим потенциалом, чем исходная ткань интактного растения.
| Содержание и состав фенольных соединений стебля чайного растения и полученной из него гетеротрофной каллусной культуры | |||||||
| Содержание, мг/г сухой массы | Качественный состав | ||||||
| ФС | ФЛ | Л | ПК | ГК | ПА | ФВ | Л |
| Молодой стебель | |||||||
| 80,0 | 66,3 | 4,0 | ++ | ++ | + | + | + |
| Каллусная культура | |||||||
| 16,2 | 10,0 | 5,0 | + | - | ++ | - | + |
ФС – фенольные соединения; ФЛ – флаваны; ПА проантоцианидины; ГК – галлокатехины и галловые эфиры катехинов; ФВ флавонолы; Л – лигнин.
Как видно из представленных данных, в каллусной культуре, происходит как уменьшение общего содержания ФС, так и обеднение их качественного спектра. Однако, способность к синтезу характерных для чайного растения флаванов (представленных простейшими катехинами и их биогенетическими аналогами проанотоцианидинами), а также фенольного полимера лигнина сохраняется. При этом содержание проантоцианидинов и лигнина оказывается даже выше, чем в исходной ткани. Как свидетельствуют данные электронно-микроскопических исследований, это обусловлено, по-видимому, активацией эндомембранной системы клеток (эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи), являющиеся местом синтеза фенилпропаноидных предшественников. Из всего этого следует, что по составу фенольного комплекса и активности фенольного метаболизма гетеротрофная каллусная культура приближается к тканям корня интактного растения.
К числу факторов, способных оказывать влияние на биосинтетический потенциал клетки, относятся гормоны и гормоноподобные соединения, а также свет.
В гетеротрофной каллусной культуре чайного растения НУК (2*10-5 М), введённая в питательную среду взамен 2,4-Д, значительно стимулирует образование растворимых ФС (примерно в 10 раз) и в меньшей степени лигнина (в 3 раза). Это согласуется с литературными данными о том, что НУК может быть использована в качестве ауксина для «продукционных» сред, т. е. сред, способствующих накоплению вторичных соединений.
В отличии от НУК, 1 мг/л кинетина (5*10-6 М) способствует главным образом лигнификации тканей ( в 3 раза по сравнению с контролем), лишь незначительно влияя на образование флаванов.
Таким образом, введением в питательную среду гормоноподобных соединений можно добиться направленной регуляции синтеза определённых типов ФС в культивируемых in vitro клетках и тканях. При этом ауксины (НУК в большей степени, чем 2,4-Д) способствуют синтезу растворимых ФС, в том числе и характерных для чайного растения флаванов, тогда как цитокинины преимущественно воздействуют на образование лигнина. При этом во всех случаях происходит лишь количественные изменения в синтезе ФС, что обусловлено, по-видимому, активацией ферментов лишь тех звеньев фенольного метаболизма, которые являются общими для изученных полифенолов.
Влияние света. Так, перенесение гетеротрофных каллусных культур чайного растения в условия непрерывного освещения во время первых двух субкультивирований приводит главным образом к увеличению образования лигнина ( в 1,5 раза), тогда как образование растворимых ФС несколько снижается.
Влияние длительного освещения на образование суммы растворимых ФС(1), флаванов(2) и лигнина(3) в каллусной культуре чайного растения (в мг/г сухой массы). К – контроль; а – темнота; б, в – свет.
При длительном же пассировании культур в условиях непрерывного освещения (7 культуральных циклов) содержание суммы растворимых ФС, а также флаванов значительно увеличивается. Как показали электронно-микроскопические исследования, это связано с формированием в ткани хлоропластов. Следует также отметить, что такие фотомиксотрофные каллусные культуры помимо флаванов синтезируют ещё один класс характерных для чайного растения ФС, а именно флавонолы. Последние представлены кемпферолом и кверцетином, а также несколькими их гликозидами. Таким образом, формирование в каллусной культуре хлоропластов, являющихся одним из центров синтеза ФС в клетках растений, оказывает значительное влияние на их биосинтетический потенциал и, главное, способствует расширению спектра синтезируемых ФС.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в случае гетеротрофных (не содержащих хлоропласты) каллусных культур усиление образования ФС при действии фитогормонов (ауксинов и цитокининов) или света ( на протяжении первых субкультивирований) происходит лишь за счёт активации ряда ферментов фенольного метаболизма (фенилаланинаммиаклиазы, 4-гидроксилазы коричной кислоты, оксициннамоил-КоА-лигазы и др.). В случае же частично фототрофных (содержащих хлоропласты) культур увеличение образования ФС происходит за счёт двух слагаемых: активации внехлоропластовых ферментных систем (как в первом случае) и благодаря функционированию в хлоропластах специализированного центра биосинтеза ФС.
3.2 Образование b-карболиновых алкалоидов в культуре ткани гармалы обыкновенной
Гармала обыкновенная (Peganum harmala) – лекарственное растение, относящееся к семейству парнолистниковых (Zygophyllaceae) и широко применяемое в народной и официальной медицине. Терапевтический эффект экстрактов гармалы, обладающих значительным влиянием на сердечно-сосудистую деятельность и на центральную нервную систему, обусловлен содержанием в ней алкалоидов, которые оказывают ингибирующее действие на такие ферменты, как моноаминооксидаза и ацетилхолинэстераза. Помимо этого, алкалоиды гармалы проявляют антибактериальную активность, которая увеличивается при использовании УФ-света, что свидетельствует об их фототоксичности.
В целом растении обнаружены два типа алкалоидов хиназолиновые, производные антраниловой кислоты, и индольные b-карболинового типа, производные триптофана. При этом надземная часть растения содержит оба типа алкалоидов, в то время как b-карболиновые алкалоиды характерны в основном для корней растения. Наиболее богаты алкалоидами семена гармалы, в которых содержание этих соединений может достигать 5 – 6 %. Корни растения в ранний период вегетации содержат около 1% алкалоидов, в то время как надземная часть – лишь 0,03%. Характер распределения алкалоидов и изменение их содержания в целом растении в течение его вегетации послужили основанием для высказывания предположения о том, что место синтеза b-карболиновых алкалоидов являются корни гармалы.
