Дипломная работа: Свободно-радикальные процессы при экспериментальной ишемии головного мозга
1.2.4. Антиоксидантная система: контроль за процессами перекисного окисления липидов при ишемии мозга
Окисление и продукция свободных радикалов является неотъемлемой частью метаболизма живых организмов. Активные формы кислорода (АФК) генерируются в различных биологических системах в ходе нормального аэробного дыхания митохондрий. Экзогенными источниками АФК является ультрафиолетовая радиация, инфекционные агенты (вирусы, бактерии), провоспалительные цитокины, окислительный стресс. В норме свободные радикалы участвуют в выполнении важнейших физиологических процессов в организме: поддержании сосудистого тонуса, в механизмах памяти, реакциях воспаления, регуляции клеточного роста. Контроль продукции АФК осуществляет антиоксидантная система, регулирующая баланс образования и устранения свободных радикалов. В состав этой системы входят ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза и др.), белки (ферритин, трансферрин, альбумин и др.) и многочисленные низкомолекулярные антиоксиданты (витамин Е, убихинол, каратиноиды, витамин С и др.).
Для мозга характерна низкая антиоксидантная защита. Именно дефицит антиоксидантной системы в мозговой ткани объясняет ее особую чувствительность к продукции свободных радикалов. Составляя всего 2% от общей массы тела, мозг утилизирует 20-25% получаемого организмом кислорода, поэтому переход в свободнорадикальную форму даже 0,1% метаболизируемого нейронами кислорода окажется токсичным для мозговой ткани [27].
В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под строгим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от чего скорость его невелика. Возникающие нарушения метаболизма при острой ишемии головного мозга ведут к повышению уровня свободных радикалов и способствуют накоплению веществ, катализирующих ПОЛ, что, в конечном итоге, и приводит к ускорению свободнорадикальных реакций, тем более что в условиях гипоксии проницаемость мембран для кислорода значительно увеличивается [44, 70]. В процессе ишемии соотношение продуктов СРО и концентрации антиоксидантов в нейрональных клетках нарушается. В связи с этим создаются "благоприятные" условия для интенсификации ПОЛ и накопления токсических липидных перекисей, которые активно разрушают структуру мембран нейронов, инактивируют ферменты и усугубляют деструктивные процессы в ткани мозга [46].
Ксантиноксидаза играет главенствующую роль в генерации АФК, вследствие чего происходит увеличение уровня свободного железа в плазме крови путем мобилизации железа с ферритином в печени. Гипоксантиокидантную реакцию можно считать одним из основных источников образования АФК, а также основной причиной СРО в ишемизированом органе [50].
Существующая в организме физиологическая антиоксидантная (АО) система представляет собой совокупную иерархию защитных механизмов клеток, тканей, органов и систем, направленных на сохранение и поддержание в пределах нормы реакций организма, в том числе в условиях ишемии. Она включает внутриклеточные антиокислительные ферментные системы, противодействующие окислительному стрессу и обезвреживающие АФК. К антиокислительным внутриклеточным ферментам относятся, прежде всего, супероксиддисмутаза (СОД), осуществляющая инактивацию супероксидного радикала, и каталаза, разлагающая перекись водорода [43, 73].
Однако регуляция интенсификации ПОЛ осуществляется не только системой СОД–каталаза. Детоксикация в фосфолипидных структурах происходит главным образом с помощью ферментов системы глутатиона, и, прежде всего, глутатионредуктазой, глутатионпероксидазой и глутатионтрансферазой [43, 55].
Особую роль в регуляции
ПОЛ играют металлы переменной валентности: Fe²
,
Cu²
, Mn²
, Co²
, из которых основным
прооксидантом в ткани мозга является железо [20, 25]. Так, в условиях церебральной патологии
ишемического генеза из клеточного депо выходит железо, находившееся там в
трехвалентном состоянии в комплексе с ферритином. Под действием
супероксид-радикала железо восстанавливается до Fe2+. Далее по реакции Фентона
(Н2О2+ Fe2+→ОН+ОН- + Fe3+) двухвалентное железо разлагает перекись водорода
с образованием гидроксильного радикала, являясь наиболее долгоживущим,
высокореакционным и токсическим для тканевого метаболизма, что в конечном итоге
приводит к гибели нейронов в условиях окислительного стресса на фоне ишемии [34].
Итак, обобщая существующие современные представления, следует подчеркнуть, что усиление СРО играет важнейшую роль в патогенезе ишемии головного мозга. В первые минуты ишемии за счет остаточного кислорода продукты липопероксидации особенно энергично накапливаются после восстановления кровоснабжения. АФК атакуют мембранные структуры клеток и их органелл, вызывая их деструкцию, деэнергизацию и гибель нейронов, что, безусловно, требует рациональной фармакологической коррекции [39].
1.3. Модели ишемии головного мозга
Существует 5 основных методик моделирования ишемии головного мозга у крыс. Метод, предложенный в работе Smrĉka M. и др. [74], заключается во введении монофиламентного волокна через разрез бифуркации аорты во внутреннюю сонную артерию, а затем интракраниально. В методе эмболизации [72] используют введение предварительно изготовленного сгустка гепаринизированной крови через катетер во внутренней сонной артерии. При использовании метода, описанного в работе Gill R. и др. [69] производят лигирование средней мозговой артерии (СМА) через трепанационное отверстие, выполненное в том месте, где артерия пересекает носовую расщелину. Метод по Tamura [56] заключается в перевязке СМА через трепанационное отверстие в области между овальным отверстием и отверстием зрительного нерва. Метод по Розвадовскому [42] заключается в лигировании общих сонных и подключичных артерий, дистальнее отхождения внутренних грудных артерий и проксимальнее отхождения позвоночных артерий.
По мнению авторов [28] наиболее эффективным методом является метод по Tamura, поскольку он позволяет более точно смоделировать патологические процессы, возникающие при развитии ишемического инсульта у людей. Однако этот метод, как и метод, описанный в работе Smrĉka M. является достаточно сложным в исполнении. Метод эмболизации и метод, описанный в работе Gill R. являются близкими по эффективности к методу по Tamura, однако также сложны и отличаются высокой себестоимостью. Метод по Розвадовскому наиболее прост в использовании, обладает низкой себестоимостью. Главным его недостатком является возникновение ишемии не только в бассейне СМА, но и в других отделах головного мозга [28].
При моделировании острой неполной ишемии головного мозга у крыс в тканях серого вещества наблюдается возрастание процесса пероксидации и антиагрегационной активности и снижение активности супероксидисмутазы. При постишемической реперфузии головного мозга в нем остается усиленным перекисное окисление липидов, возрастает активность антиоксидантных ферментов, нормализуются тромбоцитоактивирующие и прокоагулянтные свойства. Изменения указанных реакций в тканях мозга приводили к нормализации агрегации тромбоцитов и свертывания крови. У больных с различными нарушениями мозгового кровообращения (ишемический и геморрагический инсульт) в тканях мозга резко активируются реакции перекисного окисления липидов, гемостаза и ингибируется фибринолиз. В крови таких больных снижаются антиоксидантные и увеличиваются гемостатические функции с ингибированием на этом фоне реакций фибринолиза.
Использование витаминов-антиоксидантов (А, Е, С, Р) в экспериментальных условиях у крыс возвращает тромбоцитоактивирующие и прокоагулянтные свойства его тканей к уровню, наблюдаемому у интактных животных. Применение на этом фоне ингибиторов агрегации тромбоцитов (аспирина, индометацина, тиклида) приводило к разным реакциям. Аспирин не предотвращал усиления агрегационных свойств тканей головного мозга, вызванных его ишемией (по-видимому, как ингибитор простациклина). Индометацин, и особенно, тиклид в этом отношении действовали более благоприятно, снижая агрегационные свойства тканей мозга.
Ткани мозга оказывают регулирующее воздействие на процессы перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы, гемостаза и фибринолиза, что имеет важное значение для течения упомянутых выше реакций не только местно (в головном мозгу), но и в общем кровотоке в условиях нормы и патологии [37].
При моделировании транзиторной фокальной ишемии головного мозга у крыс, производят перевязку средней мозговой артерии.
В опытах на крысах линии Вистар, у которых моделировали неполную глобальную ишемию мозга путем двусторонней перевязки сонных артерий, обнаружено двукратное увеличение генерации оксида азота (NO) и умеренное повышение содержания вторичных продуктов перекисного окисления липидов в коре мозга, при этом выявлена высокая степень корреляции между содержанием NO и выраженностью неврологического дефицита у ишемизированных животных [58].
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы исследования
Объектом исследования служили цельная кровь и сыворотка крови 56 половозрелых самцов крыс линии Вистар массой 221,2±30,9 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище [3].
В эксперименте воспроизводились неполная ишемия головного мозга и механизм реперфузионного повреждения головного мозга [3].
Все процедуры эксперимента соответствовали требованиям Международных правил гуманного отношения к животным, отраженным в Санитарных правилах по оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) [3].
Выбор объекта эксперимента был обусловлен сходством ангиоархитектоники головного мозга крыс и человека, а также близостью основных гемодинамических параметров [3].
Животных декапитировали под эфирным наркозом (предварительно оценив состояние неврологической сферы по шкале Mc Graw‚ 1977) и производили забор крови. Для получения сыворотки кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течении 15 мин. Из эксперимента исключалась гемолизированная сыворотка. Сыворотка использовалась в качестве источника МДА [3].
В работе были использованы семь групп животных (табл.1).
Таблица 1. Группы экспериментальных животных.
| Группа животных (n=58) | Тип вмешательства |
| 1 серия (n=8 ) | 2-часовая окклюзия |
| 2 серия (n=8) | 1 сутки после 2-часовой окклюзии |
| 3 серия (n=8 ) | 3 суток после 2-часовой окклюзии |
| 4 серия (n=8 ) | 2-часовая окклюзия + 2-часовая реперфузия |
| 5 серия (n=8 ) | 1 сутки после 2-часовой окклюзии + реперфузии |
| 6 серия (n=8 ) | 3 суток после 2-часовй окклюзии + реперфузии |
| 7 серия (n=8) | Контрольная группа животных (ложнооперированные) |
2.2. Методы исследования
2.2.1. Моделирование неполной ишемии у крыс
В эксперименте воспроизводились неполная ишемия головного мозга и механизм реперфузионного повреждения головного мозга. С этой целью в нижней трети шеи производился кожный разрез, с обеих сторон выделялся сосудисто-нервный пучок и на общие сонные артерии после их препаровки накладывалась лигатура.
Рис 1. Строение виллизиевого круга крысы (по И. В. Ганнушкиной)
Ишемия головного мозга осуществлялась полной перевязкой обеих сонных артерий. Для создания реперфузионной модели ишемического повреждения на обе общие сонные артерии на 1 час накладывались клипсы, после чего кровоток по общим сонным артериям восстанавливали, добиваясь реперфузии ранее ишемизированной ткани.
Контрольную группу составляло 8 животных аналогичного пола и массы. У животных контрольной группы воспроизводилась наркотизация, кожный разрез и выделение артерий без последующей перевязки сосудов. Все хирургические процедуры проводили под наркозом (внутрибрюшное введение тиопентала натрия в дозе 40-50 мг/кг, растворенного в 1 мл физиологического раствора).
О тяжести ишемического повреждения судили по степени неврологического дефицита, оцениваемого по шкале Stroke-index Mс Graw в модификации НИИ неврологии РАМН через 2 часа после оперативного вмешательства и по динамике неврологического дефицита на 1-е и 3-и сутки (Приложение 1. табл.1).
2.2.2. Метод определения концентрации малонового диальдегида в
сыворотке крови
Концентрацию малонового диальдегида определяли по методу Uchiyama M., Mihara M. [75]. К 3 мл 1,4 % ортофосфорной кислоты добавляли 0,25 мл сыворотки крови, затем приливали 1 мл 0,5 % раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали в кипящую водяную баню на 45 минут. Пробы охлаждали, добавляли 4 мл бутанола и встряхивали в течение 1 мин до образования суспензии.
После центрифугирования супернатант, фотометрировали при двух длинах волн λ=535 нм и λ=570 нм против холостой пробы в кювете с длинной оптического пути 1 см. расчет содержания ТБК-активных продуктов проводили по формуле С=(D535 - D 570 )/0,156 х 16, где С – концентрация ТБК-активных продуктов в опытной пробе; D535 - оптическая плотность пробы при 535 нм; D570 оптическая плотность при 570 нм; 0,156 – коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид-ТБК в л/мкмоль/см; 16 – коэффициент разведения сыворотки.
2.2.3. Метод люминолзависимой хемилюминесценции в цельной крови
Хемилюминесценцию измеряли на аппарате ХЛМ-003 в соответствии с инструкцией к прибору и методическими рекомендациями авторов разработки [10, 23, 59, 60].
Перед исследованием отбирали необходимое количество рабочего раствора люминола из расчета 2 мл на одну пробу и нагревали в термостате до 37 °С. Предварительно разливали по 2 мл раствора в стаканчики для измерения хемилюминесценции, которые также помещали в термостат. В 2 мл теплого раствора люминола добавляли 0,1 мл гепаринизированной крови, тщательно перемешивали и помещали в кюветную камеру прибора, настроенного по программе КРОВЬ (термостат включен, мешалка выключена, время измерения 10 минут).
2.3. Статистическая обработка результатов исследования
Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха от 25 (low quartile) до 75 квартиля ( high quartile) [40].
Сравнение между группами было выполнено с использованием теста Манна – Уитни, при сравнении более 2 групп применялся тест Крускала – Уоллиса. Для сравнения относительных величин применялся критерий χ². Для исследования корреляционных взаимодействий выполнялся корреляционный анализ Спирмена.
Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Все статистические расчеты проводились с помощью пакета программ "Statistica 5,5".
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Свободнорадикальные процессы при ишемическом инсульте
Ишемия мозга сопровождается развитием сложного каскада патобиохимических реакций. Согласно современным представлениям, взаимодействие избыточных концентраций возбуждающих нейромедиаторов (глутамата) с N-метил-D-аспартатными рецепторами приводит к увеличению концентрации свободного кальция в цитоплазме нервных клеток. Содержание свободного Са2+ возрастает и в результате открытия потенциалзависимых ионных каналов при деполяризации нейронов, а также выхода кальция из внутриклеточных депо (эндоплазматического ретикулума, митохондрий). Последующая активация кальцийзависимых ферментов, в т.ч. и конститутивной NOS, приводит к усилению синтеза NO и формированию других свободных радикалов (супероксида, гидроксирадикалов, перекиси водорода).
Т.о., оксидантный стресс выступает как один из ведущих факторов повреждения мозга при ишемии. В нашей работе оценка показателей, характеризующих свободнорадикальной окисление, осуществлялась по определению концентрации ТБК-активных продуктов – малонового диальдегида (МДА), показателям люминолзависимой хемилюминесценции.
