Дипломная работа: Свободно-радикальные процессы при экспериментальной ишемии головного мозга
Этап амплификации создаёт условия для третьего этапа – экспрессии, на котором происходят необратимые изменения, приводящие к клеточной смерти. Механизмы, непосредственно повреждающие нейроны и глию, изучены наиболее полно [21].
Избыточное внутриклеточное накопление ионов Са2+ активирует внутриклеточные энзимы: липазы, протеазы, эндонуклеазы и запускает каскадный механизм ферментативных реакций, приводящих к катаболическому повреждению нейрона. Особенно разрушителен распад фосфолипидов в наружной клеточной мембране и в мембранах внутриклеточных органелл [21].
Таким образом‚ схема последовательных этапов «ишемического каскада» на основе причинно-следственных связей может иметь вид:
1) снижение мозгового кровотока;
2) глутаматная «эксайтотоксичность»;
3) внутриклеточное накопление ионов кальция;
4) активация внутриклеточных ферментов;
5) повышение синтеза оксида азота и развитие оксидантного стресса;
6) экспрессия генов раннего реагирования;
7)
отдаленные последствия ишемии (реакции местного воспаления,
микрососудистые нарушения, повреждения гематоэнцефалического
барьера);
8) апоптоз [45].
Ведущим патогенетическим механизмом ишемической смерти нейронов является избыточная активация глутаматных рецепторов. При этом происходящие в мозге эксайтотоксические процессы неразрывно связаны с параллельно протекающими реакциями образования оксида азота, свободнорадикального окисления, воспаления.
1.2. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита
при патологии головного мозга
Свободнорадикальное окисление (СРО) – важный
и многогранный
биохимический процесс превращений кислорода, липидов, нуклеиновых
кислот, белков и других соединений под действием свободных радикалов
(СР), а перекисное окисление липидов (ПОЛ) – одно из его
последствий [16].
1.2.1. Свободнорадикальное окисление: общие сведения
Свободные радикалы представляют собой соединения, имеющие неспаренный электрон на наружной орбитали и обладающие высокой реакционной способностью. К числу первичных свободных радикалов относятся супероксидный анион-радикал, окись азота, а вторичными свободными радикалами являются гидроксильный радикал, синклетный кислород, перекись водорода, пероксинитрит. Образование свободных радикалов тесно связано, с одной стороны, с появлением свободных электронов при нарушениях процессов окисления в дыхательной цепи, превращении ксантина, синтезе лейкотриенов и простагландинов. Эти реакции зависят от активности ксантиноксидазы, дегидротатдегидрогеназы, альдегидоксидазы холестериноксидазы, ферментов цитохрома Р-450. Синтез супероксид-аниона инициируется ангиотензином II, который образуется из ангиотензина I под действием ангиотензинпревращающего фермента [16].
Супероксид-анион может восстанавливать Fe3+ в Fe2+, при взаимодействии которого с перекисью водорода, перекисями липидов и гипохлоритом образуются высокотоксичные вторичные радикалы. Из всех свободных радикалов наибольшей активностью обладают гидроксильный радикал и пероксинитрит.
Активность свободных радикалов ограничивается антиоксидантами, которые разрывают цепи молекул при реакциях СРО, разрушают молекулы перекисей.
К числу ферментных антиоксидантов относятся супероксиддисмутаза (СОД), глютатионпероксидаза, каталаза, находящиеся в клеточных структурах. Неферментные антиоксиданты – витамины Е, К, С, убихиноны, триптофан, фенилаланин, церулоплазмин, трансферрин, гаптоглобин, глюкоза, каротиноиды блокируют активность свободных радикалов в крови. Изменения структуры и функции субстратов, на которые действуют свободные радикалы, зависит, в конечном счете, от соотношения активности СР и антиоксидантов.
Свободнорадикальное окисление необходимо для нормального функционирования организма. Об этом свидетельствует, в частности, потребление более 5 % кислорода на образование супероксидного анион-радикала. СРО способствует уничтожению отживших клеток, элиминации ксенобиотиков, предупреждает злокачественную трансформацию клеток, моделирует энергетические процессы за счет активности дыхательной цепи в митохондриях, пролиферацию и дифференциацию клеток, транспорт ионов, участвует в регуляции проницаемости клеточных мембран, в разрушении поврежденных хромосом, в обеспечении действия инсулина. СРО генерирует внутриклеточные бактерицидные и вирусоцидные факторы, особенно в клеточном ядре [1, 22, 49].
Снижение поступления в нейроны молекулярного кислорода и повышение уровня восстановленности компонентов дыхательной цепи стимулируют восстановление кислорода по одноэлектронному пути с образованием свободных радикалов (супероксид-аниона, пероксильного и гидроксильного радикалов), а также оксидантов нерадикальной природы (пероксида водорода и аниона гипохлорита), поскольку (О2)- легко реагирует с промежуточными компонентами дыхательной цепи в восстановленном состоянии. Высокореакционноспособные радикалы кислорода вызывают окисление биомакромолекул, а также инициируют цепные процессы перекисного окисления мембранных липидах (ПОЛ), прямое окислительное повреждение нуклеиновых кислот (НК) и белков.
Образующееся в процессе ПОЛ гидроперекиси неустойчивы, их распад приводит к появлению разнообразных вторичных и конечных продуктов ПОЛ, представляющих собой высокотоксичные соединения (диеновые коньюгаты, шиффовы основания и др.), которые оказывают повреждающее действие на мембраны и клеточные структуры. Как следствие образуются сшивки биополимеров, определяются набуханием митохондрий и разобщение окислительного фосфорилирования, инактивация тиоловых ферментов, участвующих в дыхании и гликолизе, дальнейшее разрушение липидной основы мембран [21].
1.2.2. Продукты перекисного окисления липидов
К первичным продуктам ПОЛ относятся циклические эндоперекиси и алифатические моно- и гидроперекиси, так называемые липопероксиды и диеновые конъюгаты [30].
Диеновые конъюгаты (ДК) являются первичными продуктами ПОЛ. При свободнорадикальном окислении арахидоновой кислоты происходит отрыв водорода в α-положении по отношению к двойной связи, что приводит к перемещению этой двойной связи с образованием ДК [64]. Диеновые конъюгаты, являющиеся первичными продуктами ПОЛ, относятся к токсическим метаболитам, которые оказывают повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты [54].
Липопероксиды являются весьма нестойкими и подвергаются дальнейшей окислительной дегенерации. При этом накапливаются вторичные продукты окисления, наиболее важными из которых являются ненасыщенные альдегиды (малоновый диальдегид). Продуктами взаимодействия малонового диальдегида с аминосодержащими соединениями являются шиффовы основания [30].
Шиффовы основания, органические соединения общей формулы RR¢C=NR¢¢ где R и R¢ - водород, алкил или арил, R¢¢ - алкил или арил (в последнем случае Ш. о. называют также анилами). Шиффовы основания кристаллические или маслообразные вещества, нерастворимые в воде, растворимые в органических растворителях. Слабые основания, в безводной среде образуют соли с кислотами, в водных растворах кислот гидролизуются до амина и альдегида, в щелочных растворах большинство Ш. о. устойчиво. Гидрируются до вторичных аминов (RR¢CH - NHR¢¢), присоединяют многие соединения, содержащие подвижный водород, например b-дикарбонильные соединения, кетоны, имины. Образуются шиффовы основания в результате обратимой реакции между карбонильной группой альдегида или кетона со свободной аминогруппой [67]. Непрерывное накопление оснований Шиффа дестабилизирует мембраны и способствует деструкции клеток [54].
ТБК-реактанты (МДА) – вторичные продукты ПОЛ. Как известно, малоновый диальдегид (МДА) образуется только из жирных кислот с тремя и более двойными связями. МДА принадлежит важная роль в синтезе простагландинов, прогестерона и других стероидов [54]. Отрицательная роль малонового диальдегида заключается в том, что он сшивает молекулы липидов и понижает текучесть мембраны. Вследствие этого мембрана становится более хрупкой. Нарушаются процессы связанные с изменением поверхности мембраны: фагоцитоз, пиноцитоз, клеточная миграция и др. [54].
Гидроперекиси, ненасыщенные альдегиды, являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью. Они подавляют активность гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибируют синтез белка и нуклеиновых кислот, нарушают секрецию триглицеридов гепатоцитами, ингибируют различные мембранносвязанные ферменты [30].
Накопление в организме продуктов ПОЛ (диеновых коньюгатов, ТБК-реактантов, шиффовых оснований) [6] и развитие эндотоксикоза приводит к стимуляции монооксигеназной системы, изменениям реакции липидного, гормонального, иммунного, микроэлементного, нейромедиаторного статусов, числа мест связывания и сродства рецепторов к лигандам, истощению антиоксидантной системы [71].
1.2.3. Процессы свободно-радикального окисления липидов в развитии и течении острых нарушений мозгового кровообращения
В развитии и течении острых нарушений мозгового кровообращения е особое значение придается усилению процессов свободнорадикального окисления липидов. Прежде всего, по причине повышенной чувствительности головного мозга к действию свободных радикалов (50% сухого вещества мозга составляют ненасыщенные жирные кислоты – основной субстрат свободно-радикального окисления.) Хотя немалую роль играет и антиоксидантная система, наделенная функциями контроля за процессами перекисного окисления липидов, при недостаточности антиоксидантной системы процессы пероксидации усиливаются, происходит избыточное образование первичных (свободных перекисных радикалов и гидроперекисей липидов) и конечных (альдегидов и кетонов) продуктов свободнорадикального окисления. И те, и другие, действуя на внешние и внутренние клеточные мембраны, вызывают возникновение мембранной патологии и энергетического дефицита. Однако более опасными считаются свободные перекисные радикалы и гидроперекиси липидов, которые оказывают не только мембраноповреждающее действие, но и обеспечивают аутокаталитический характер перекисного окисления липидов [35].
Согласно бытующему мнению, резкое увеличение продукции свободных радикалов приходится на постишемический период, на стадию восстановления мозгового кровообращения. Вместе с тем некоторые исследователи не исключают возможность образования свободных радикалов даже при понижении парциального давления кислорода в тканях с нарушенным кровоснабжением, поскольку повышение степени восстановленности митохондриальной дыхательной цепи позволяет кислороду в период острой ишемии взаимодействовать с промежуточными компонентами этой цепи убихинонами – с образованием супероксиданиона [35].
При острой мозговой ишемии на фоне дисбаланса оксидантно-антиоксидантной системы происходит активация процессов перекисного окисления липидов, что «в совокупности вызывает развитие дистрофических и деструктивных изменений нейрональных мембран и формирование неврологического дефицита» [35].
1.2.3.1. Малоновый диальдегид как интегральный показатель
процессов свободнорадикального окисления
Как правило процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) оцениваются по скорости и количеству образования одного из конечных продуктов окисления – малонового диальдегида (МДА).
Малоновый диальдегид (β-диальдегид):
Н – С – СН2 С – Н
║ ║
О О
Активность малонового диальдегида поддерживается на определенном уровне при участии ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ), что позволяет говорить о перекисном гомеостазе. Нормальная концентрация в крови – 2,5-6,0 мкМ/л. Увеличение концентрации – свидетельство усиленного ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты [2].
Определение количества образующегося малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБ-К) может быть одним из методов оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов [48, 57]. В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм [41].
При ишемии мозга в большей степени повышаются вторичные продукты ПОЛ (МДА), а при реперфузии – первичные [4, 36].
Исследование вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, подтверждает роль перекисного окисления в механизмах развития острой фокальной ишемии мозга и формирования инфарктных повреждений.
1.2.3.2. Биохемилюминесценция как метод оценки состояния свободнорадикальных процессов при ишемическом инсульте головного мозга
Одним из методов оценки свободнорадикальных процессов при ишемии головного мозга является хемилюминесценция. Хемилюминесценцией (ХЛМ) называется свечение, сопровождающее химические реакции. Она наблюдается в том случае, если в реакции происходит выделение большого количества энергии, например в реакции взаимодействия двух радикалов или в реакциях с участием перекисей. Собственное ("сверхслабое") свечение клеток и тканей животных и человека обусловлено реакциями свободных радикалов: радикалов липидов и кислорода, а также окиси азота, – соединениями, играющими огромную роль в жизни организма, а при определенных условиях – и развитии ряда патологических состояний [12].
Регистрация индуцированной биохемилюминесценции биологических объектов является современным методом для изучения интенсивности свободнорадикальных процессов, в частности перекисного окисления липидов. Он применяется для диагностики нарушений липидного обмена, воспалительных, инфекционных и онкологических заболеваний. В клинических условиях хемилюминесцентный показатель может быть применен для определения остроты процесса, степени тяжести по динамике значений хемилюминесценции.
Метод хемилюминесценции применяется также для определения фагоцитарной активности клеток крови. Он основан на регистрации активных форм кислорода, образующихся в процессе фагоцитоза, и связан с их фагоцитарной активностью [63].
Метод люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛМ) характеризует интенсивность «респираторного взрыва», то есть генерации O2• , O2 и ОН• лейкоцитами при активации клеток [24].
ЛХЛ цельной крови можно наблюдать в течение 10-12 часов, причем при её разведении физиологическим раствором или раствором Хенкса интенсивность ХЛМ увеличивается [13].
Метод люминолзависимой хемилюминисценции можно применять как метод оценки состояния свободнорадикальных процессов при ишемическом инсульте головного мозга.
Известно‚ что на первые сутки заболевания у всех больных независимо от тяжести инсульта интенсивность – как спонтанной, так и индуцированной – хемилюминесценции сыворотки крови возрастает по сравнению с контрольной группой, что указывает на активацию процессов свободнорадикального окисления [38]. В этот же период резко увеличивается амплитуда «быстрой» вспышки (т. е. интенсивность свечения в момент введения индуктора), отражающая состояние оксидантной системы, и достоверно увеличивается коэффициент затухания (т. е. отношение максимальной амплитуды свечения к минимальной), что косвенно свидетельствует о дисбалансе оксидантно-антиоксидантной системы.
В дальнейшем, на седьмые сутки, картина меняется. В сравнении с началом заболевания у всех больных уменьшается амплитуда «быстрой» вспышки и достоверно увеличивается коэффициент затухания. Вместе с тем у больных с ишемическим инсультом легкой степени тяжести продолжается незначительное нарастание процессов пероксидации. У больных с инсультом средней тяжести снижение индуцированной хемилюминесценции сопровождается достоверным повышением спонтанной хемилюминесценции в сравнении с первыми сутками заболевания [35].
У больных перенесших повторные нарушения мозгового кровообращения, напряжены обе системы и оксидантная, и антиоксидантная. У больных с одним или несколькими инсультами в анамнезе дела обстоят иначе: у них активация оксидантной системы сочетается с истощением антиоксидантной системы, что ведет к более активной деструкции мозговой ткани при гипоксии головного мозга [35].
