Реферат: Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину
В плазмі крові мишей всіх груп на різних етапах спостереження за ростом пухлин виявлено зниження рівня б2М у порівнянні з відповідним показником у інтактних тварин. Встановлено, що підвищення ступеня резистентност карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зниженням рівня б2М в латентний період росту пухлини. Зокрема, вміст інгібітора в плазмі крові тварин з пухлинами LLC-19 і LLC-27 знижувався відповідно на 23,3% та 30,8% у порівнянн з інтактним контролем (р<0,05). Для пухлин LLC і LLC-9 таких змін не виявлено. Вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлиною LLC-27 був зниженим на 27,2% порівняно з таким у плазмі крові тварин з пухлиною LLC (р<0,05).
Зниження чутливості карциноми карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжувалось також порушенням співвідношення між рівнями ПРА та б2М в плазмі крові в бік підвищення ПРА та дефіциту інгібітора. Порушення даної рівноваги було найбільш виражене в плазмі крові мишей з пухлинами LLC-19 та LLC-27 (табл. 5).
Таким чином, співвідношення “фермент-інгібітор” при розвитку резистентност карциноми легені Льюїс до цисплатину свідчить про зниження рівнів б1-ІП та б2М відносно рівня активності протеолітичних ферментів.
ПРА та вміст б1-ІП у тканині карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину. Загальновідомо, що одним з можливих джерел надходження протеолітичних ферментів та їх інгібіторів у кровоносне русло може бути синтез їх злоякісними клітинами з подальшою секрецією в позаклітинний простір. За цих обставин цікаво було співставити зміни рівнів ПРА і б1-ІП в пухлинній тканині та плазмі крові мишей з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс.
Результати проведених досліджень свідчать, що на всіх етапах спостереження рівень ПРА в тканин пухлини LLC-27 значно перевищував такий у пухлині LLC. Так, зокрема, на 15 добу рівень ПРА в тканині пухлини LLC-27 в 61,8 рази перевищував такий у тканині пухлини LLC (р<0,001). Протягом подальших періодів спостереження за пухлинним ростом відмічали значно менше, але все ще достатньо суттєве підвищення ПРА в резистентній карциномі легені Льюїс: на 20 добу рівень ПРА в резистентній пухлині перевищував такий у вихідній у 8,6 разів (р<0,001), а на 25 добу – у 4,2 рази (р<0,001). Цілком очевидно, що такі зміни ПРА можна розглядати як одну з причин підвищення нтенсивності метастазування пухлини LLС-27, оскільки посилення протеолізу обумовлю підвищення інвазивних властивостей злоякісних клітин, а також їх міграційну здатність. В той же час, вміст б1-ІП в тканині пухлин LLС-27 був значно нижчим (на 49,5%) у порівнянні з таким у тканині пухлин LLC (р<0,001).
Співставлення рівнів ПРА і б1-ІП в тканині пухлини і плазмі крові на окремих етапах пухлинного росту, на нашу думку, може бути достатньо інформативним для розуміння ролі системи протеолізу в пухлинній прогресії. Така думка виглядає переконливою завдяки співставленню рівня ПРА і вмісту б1-ІП на 25 добу після перещеплення пухлин (період масової появи метастазів у легенях тварин). Показово, що саме в цей період у тварин з вихідною карциномою легені Льюїс спостерігається підвищення рівнів ПРА і б1-ІП у тканині пухлини, і навпаки, зниження рівнів ПРА та б1-ІП у плазмі крові. Що стосується змін ПРА і рівня б1-ІП у тварин з резистентними пухлинами, то тут і в тканині пухлини, і в плазмі крові, має місце суттєве наростання ПРА і рівня б1-ІП.
Таким чином, порівняння динаміки змін показників системи протеолізу в організмі мишей з вихідною і резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс свідчить, що і в тканині пухлини LLC-27, і в плазмі крові мишей з відповідною пухлиною, рівні ПРА значно вищими порівняно з такими при рості вихідної пухлини LLC. Таке наростання ПРА в пухлинах LLC-27 призводить до зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік посилення протеолізу та дефіциту основних інгібіторів протеїназ, що, в свою чергу, обумовлює підвищення інтенсивності метастазування даних пухлин.
В підтримку цього твердження свідчить також величина співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП у пухлинній тканині (табл. 6).
Відповідно, можна констатувати, що розвиток резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зміщенням протеїназно-інгібіторного балансу в тканині пухлини у бік підвищення ПРА. Як було зазначено вище, аналогічні зміни спостерігаються і в плазмі крові тварин. Тому можна припустити, що значні відмінност протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові тварин з пухлинами LLC та LLC-27 обумовлені порушенням рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами безпосередньо в тканині пухлини.
Кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, б1-ІП
б2М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю
до цисплатину. Аналіз
кореляційних зв’язків між пухлинним процесом (динаміка змін об’єму пухлини) та динамікою
змін показників системи протеолізу показав відсутність кореляційних залежностей
між об’ємом пухлини та ПРА чи рівнями б1-ІП і б2М в плазм
крові щурів з вихідною карциномою Герена. Натомість, в плазмі крові щурів з резистентною
до цисплатину карциномою Герена виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом
пухлини та ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), між об’ємом пухлини і рівнем б1-ІП
(r = 0,67; p = 0,000002). Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями
ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1-ІП
(rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми леген
Льюїс при розвитку резистентності до цисплатину. В пухлинній тканині також встановлено
кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс
та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001).
ВИСНОВКИ
На експериментальних моделях карциноми Герена та карциноми леген Льюїс встановлено, що формування резистентності пухлин до цисплатину асоціюється зі змінами кінетики їх росту та супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині.
1. Виявлено, що для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 3,3 рази) та підвищення швидкості її росту в експоненційній фазі (в 2,0 рази) порівняно з вихідною пухлиною.
2. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми Герена в плазм крові щурів зростають рівні ПРА (в 2,4 рази) і б1-ІП (на 28,5%) та дещо знижується (на 18,0%) рівень б2М порівняно з такими у тварин з вихідною пухлиною.
3. Встановлено, що кінетика росту та інтенсивність метастазування резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс визначається ступенем її резистентності: для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 2,0 рази), підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,4 і 3,7 рази, відповідно) та підвищення інтенсивності метастазування (LLC-27). Для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не є характерними.
4. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс зміна рівнів ПРА в плазмі крові визначається ступенем резистентності: для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) характерним є незначне підвищення ПРА (в 1,4 рази), для пухлин з середнім (LLC-19) та високим (LLC-27) ступенем резистентност значне підвищення ПРА (в 2,1 та 4,1 рази, відповідно). Розвиток резистентност пухлини до цитостатику супроводжується підвищенням рівня б1-ІП (на 58,5% для пухлини LLC-27) в експоненційній фазі її росту та зниженням рівня б2М в латентний період росту (на 27,2% для пухлини LLC-27).
5. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА (в 4,2 – 61,8 рази) у порівнянні з таким у вихідній пухлині, а вміст б1-ІП, навпаки, знижується (на 49,5%).
6. Встановлено, що розвиток резистентності до цисплатину карциноми Герена та карциноми легені Льюїс супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині в бік підвищення рівня ПРА.
7. В плазмі кров щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена, на відміну від вихідної пухлини, виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,7) і б1-ІП (rho = 0,67). Визначено також пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42) і б1-ІП (rho = 0,65) в плазмі крові мишей з резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс (LLC-27). Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5) і б1-ІП (rho = 0,76) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Yurchenko O.V., Todor I.N., Tryndyak V.P., Tregubova N.A., Kovtonyuk O.V., Solyanik G.I., Kulik G.I., Chekhun V.F. Resistance of Guerin’s carcinoma cells to cisplatine: biochemical and morphological aspects // Exp. Oncol. – 2003. – Vol.25, № 1. – P. 64 – 68. (Особистий внесок здобувача: підібрано і проаналізовано наукову літературу за темою статті, здійснено аналіз та математичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).
2. Chekhun V.F., Kovtonyuk O.V., Todor I.N., Kulik G.I. Total proteolytic activity and levels of the main proteinases inhibitors in blood plasma of mice bearing Lewis lung carcinoma upon development of resistance to cisplatin // Exp. Oncol. – 2005. – Vol.27, №4. P. 286 – 289. (Особистий внесок здобувача: проведено експериментальну частину роботи, самостійно визначено показники протеолітичної системи, вивчено кінетику росту пухлин, проведено статистичну обробку результатів, проаналізовано результати дослідження та підготовлено публікацію до друку).
3. Тодор И.Н., Кузьменко А.П., Трегубова Н.А., Трындяк В.П., Ковтонюк О.В., Кунская Л.Н., Стеблянко Т.И., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Лекарственная резистентность опухолей и метастазирование в эксперименте // Укр. мед. альманах. – 2006. – Т. 9, №4. – С.111 – 112. (Особистий внесок здобувача: проведено визначення протеолітичної активності та дослідження кінетики росту первинних пухлин).
4. Патент на винахід України 76922, (51) МПК (2006) G01N 33/50 A61K31/282 (2006.01). Спосіб виявлення чутливості злоякісних пухлин до дії цисплатину // Чехун В.Ф., Ковтонюк О.В., Тодор І.М., Кулик Г.І.. Заявл. 02.06.2005; Опубл. 15.09.2006. – Бюл. №9. – 8 с. (Особистий внесок здобувача: проведено планування схеми експерименту, самостійно визначено протеолітичну активність, проведено дослідження ефективності протипухлинної хіміотерапії, здійснено аналіз та математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).
5. Ковтонюк О.В., Призимирська Т.В., Тодор І.М., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Дослідження активності серинових протеїназ та їх інгібіторів в плазмі крові мишей в динаміці розвитку карциноми 3LL з індукованою резистентністю до цисплатини // Тези VI конференції молодих онкологів України “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, 4–5 грудня 2003 р. – Київ. – 2003. – С. 24.
6. Тодор И.Н., Трегубова Н.А., Трындяк В.П., Ковтонюк О.В., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Особенности метаболизма и ультраструктуры метастазирующей карциномы легких Льюис при формировании резистентности к цисплатине // Материалы III Съезда онкологов и радиологов СНГ, 25 – 28 Мая 2004. – Минск. – 2004. – Ч. 1. – С.351.
7. Chekhun V.F., Kulik G.I., Todor I.N., Kovtonyuk O.V. Proteolytic activity and antiproteases at metastasis of cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant Lewis lung carcinoma // Abstract Book. 18 European association for cancer research, 3 – 6 July 2004. – Innsbruck, Austria. – 2004. – P. 320.
8. Kovtonyuk O.V., Chekhun V.F.,Todor I.N., Kulyk G.I. Character of changes in the total proteolytic activity and the content of main proteinase inhibitors in blood plasma of C57Bl/6 mice upon the cisplatin resistance development of Lewis lung carcinoma // International Student Congress of Medical Sciences, 15 – 18 June, 2005. – Groningen, The Netherlands. – 2005. – P. 54.
9. Ковтонюк О.В., Тодор І. М., Кулик Г. И., Чехун В.Ф. Протеолітична активність у плазмі крові мишей з карциномою легені Льюїс та щурів з карциномою Герена при формуванні резистентност до цисплатину // Тези ІІ науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів Актуальні проблеми фармакології та токсикології”, 22 грудня 2005 р. – Київ. – 2005. С. 44.
10. Kovtonyuk O.V., Todor I.N., Kulik G.I., Chekhun V.F. Proteolytic activity and content of alpha-1-proteinase inhibitor upon the growth of mice with Lewis lung carcinoma in the blood plasma and tumor tissue // International Medical Students’ Congress Novi Sad. – Serbia. – 2006. – P. 20.
11. Kovtonyuk O.V., Chekhun V.F., Todor I.N., Kulyk G.I. Proteolytic activity and content of alpha-1-proteinase inhibitor in cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant Lewis lung carcinoma // 17 European Student’s Conference: Abstract Book, 8 – 12 October, 2006, – Berlin, Germany / European Journal of Medical Research. – 2006. – Vol. 11. – P. 123 – 124.
12. Ковтонюк О.В., Чехун В.Ф., Тодор І.М., Кулик Г.І. Протеолітична активність та вміст б1-інгібітору протеїназ в плазмі крові та тканині пухлини мишей при формуванні резистентност карциноми LLC до цисплатину // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференц з міжнародною участю: “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, 2 – 3 листопада 2006 р., Київ /Онкологія. – 2006. – Т. 5. 2. – С. 177 – 178.
13. Чехун В.Ф., Ковтонюк О.В., Кулик Г.И., Тодор И.Н. Развитие лекарственной резистентности in vivo и активность компонентов системы протеолиза // Материалы съезда IV съезда онкологов и радиологов СНГ, 2006. – Баку: НЦО Минздрава Азербайджанской Республики, 2006. С. 50.
АНОТАЦІЯ
Ковтонюк О.В. Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 – онкологія. – Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ – 2008.
Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині в динаміці росту карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
В експериментах in vivo було показано, що зниження чутливост злоякісних пухлин до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту та підвищенням швидкості росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням сумарно протеолітичної активності (ПРА) і рівня б1-інгібітора протеїназ (б1-ІП) та зниженням рівня б2-макроглобуліну (б2М) в плазмі кров тварин. Виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентних пухлин та рівнями ПРА і б1-ІП в плазмі крові та пухлинній тканині. Cпіввідношення рівнів ПРА/б1-ІП у плазмі крові та пухлинній тканині свідчить про суттєве зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік підвищення ПРА при розвитку резистентност пухлин до цисплатину.
Показано, що формування резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується підвищенням інтенсивності метастазування на фоні підвищення ПРА в плазмі крові та пухлинній тканині.
Ключові слова: протеїназно-інгібіторний баланс, серинові протеїнази, протеолітична активність, б1-інгібітор протеїназ, б2-макроглобулін, лікарська резистентність, цисплатин, карцинома Герена, карцинома легені Льюїс, кінетика пухлинного росту, метастазування.
АННОТАЦИЯ
Ковтонюк О.В. Изменения протеиназно-ингибиторного баланса при росте злокачественных опухолей с индуцированной резистентностью к цисплатину. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 – онкология. – Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, Киев – 2008.
Диссертационная работа посвящена изучению особенностей протеиназно-ингибиторного баланса в динамике роста карциномы Герена и карциномы легкого Льюис с индуцированной резистентностью к действию противоопухолевого препарата цисплатина. Цель работы состояла в изучении общей протеолитической активности (ПРА) и уровня основных ингибиторов протеолитических ферментов – б1-ингибитора протеиназ (б1-ИП) и б2-макроглобулина (б2М) в плазме крови и опухолевой ткани экспериментальных животных, которым были перевиты подштаммы карциномы Герена и карциномы легкого Льюис с различной чувствительностью к цисплатину.
Эксперименты были проведены на 140 крысах линии Вистар и 478 мышах линии C57Bl/6. Формирование резистентности к цисплатину проводили путем последовательных перевивок клеток опухоли, полученных от животных, которым вводили цитостатик.
В серии экспериментов с карциномой легкого Льюис использовали опухолевые подштаммы, полученные на разных этапах формирования резистентности: LLC-9 (начальный этап), LLC-19 (промежуточный этап), LLC-27 (конечный этап). В экспериментах с карциномой Герена использовали опухолевый подштамм, полученный на конечном этапе формирования резистентности к цисплатину (GC/R). В качестве контрольных групп использовали животных с исходными (чувствительными к действию цисплатина) опухолями – карциномой Герена (GC) и карциномой легкого Льюис (LLC).
Было показано, что формирование резистентности к цисплатину карциномы Герена и карциномы легкого Льюис сопровождается существенными изменениями кинетики опухолевого роста, проявляющимися в пролонгации латентного периода роста (в 3,3 раза для GC/R; в 2,0 раза для LLC-19 и LLC-27) с последующим увеличением скорости роста в экспоненциальной фазе (в 2,0 раза для GC/R; в 3,3 и 3,7 раза для LLC-19 и LLC-27, соответственно). Установлено, что изменение кинетики роста карциномы Герена и карциномы легкого Льюис при развитии их резистентности к цисплатину сопровождается повышением ПРА и увеличением уровня основного ингибитора протеиназ – б1-ИП в плазме крови. В частности, выявлено прямую корреляционную зависимость между объёмом резистентной карциномы Герена и уровнем ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), а также объёмом опухоли и уровнем б1-ИП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазме крови. Прямая корреляционная зависимость между объёмом опухоли и уровнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) и б1-ИП (rho = 0,65; p = 0,001) обнаружена также в плазме крови мышей с резистентной к цисплатину карциномой легкого Льюис (LLC-27). Необходимо отметить, что аналогичная корреляционная зависимость между объёмом опухоли и уровнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) и б1-ИП (rho = 0,76; p = 0,0001) была выявлена непосредственно и в опухолевой ткани (LLC-27).
Соотношение уровней ПРА/б1-ИП свидетельствует о существенном смещении равновесия между активностью протеолитических ферментов и уровнем их эндогенного ингибитора (в сторону увеличения ПРА) в условиях развития резистентности карциномы Герена и карциномы легкого Льюис к цисплатину, несмотря на то, что уровень б1-ИП в плазме крови животных с резистентными опухолями значительно превышает такой в плазме крови животных с исходными опухолями. Таким изменениям протеиназно-ингибиторного баланса в плазме крови предшествуют изменения уровней ПРА и б1-ИП в опухолевой ткани. В частности, на модели карциномы легкого Льюис показано, что уровень ПРА в ткани резистентной опухоли (LLC-27) значительно превышал такой в ткани исходной опухоли (LLC), в то время как уровень ингибитора в ткани резистентной опухоли, наоборот, был снижен.
Развитие исходной карциномы легкого Льюис и ее резистентных подштаммов сопровождалось снижением концентрации б2М в плазме крови. Соотношение ПРА/б2М свидетельствует о более выраженом дефиците ингибитора в плазме крови животных с резистентными к цисплатину подштамами опухолей. Подобное изменение протеиназно-ингибиторного баланса ассоциируется с увеличением интенсивности метастазирования карциномы легкого Льюис при снижении ее чувствительности к цисплатину (LLC-27).
Ключевые слова: протеиназно-ингибиторный баланс, сериновые протеиназы, протеолитическая активность, б1-ингибитор протеиназ, б2-макроглобулин, лекарственная резистентность, цисплатин, карцинома Герена, карцинома легкого Льюис, кинетика опухолевого роста, метастазирование.
ANNOTATION
Kovtonyuk O.V. Сhange of the proteinase-antiproteinase balance during growth of malignant tumours with induced cisplatin resistance. – Manuscript.
Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 14.01.07 – Oncology. – R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Scienсes of Ukraine, Kyiv – 2008.
The thesis is devoted to the study of the proteinase-antiproteinase balance in the dynamics of the growth of Guerin carcinoma and Lewis lung carcinoma with induced cisplatin resistance.
The decrease of tumour cisplatin sensitivity in vivo was shown to be accompanied by significant changes of the kinetics of tumour growth: prolonged latent growth period and increase of exponential phase growth rate. The change of the growth kinetics has been found to associate with the elevation of total proteolytic activity (TРА) as well as the level of б1-proteinase inhibitor (alpha1PI) and decrease б2-macroglobuline (alpha2M) level in blood plasma. A direct correlation dependence of the volume of resistant Guerin carcinoma and Lewis lung carcinoma, TPA and alpha1PI levels in blood plasma and tumour tissue is determined. The value of TPA/alpha1PI ratio has shown that the development of tumour cisplatin resistance is accompanied by the imbalance between proteolytic and antiproteolytic activities shifted to the TPA increase in blood plasma and tumour tissue.
The development of Lewis lung carcinoma cisplatin drug resistance is accompanied by the increase of its metastasis together with the elevation of TPA in blood plasma.
Key words: proteinase-antiproteinase balance, serine proteinases, total proteolytic activity, б1-proteinase inhibitor, б2-macroglobuline, drug resistance, cisplatin, Guerin carcinoma, Lewis lung carcinoma, tumour growth kinetics, metastasis.
