Реферат: Мутация вирусов, характеристика мутагенов
Изменчивость вирусов при пассажах
Изменчивость вирусов при пассажах на животных.
Основоположником этого метода изменения наследственности вирусов был Пастер (1882 год), впервые получивший живую антирабическую вакцину путем серийных пассажей через мозг кролика дикого (вирулентного) штамма вируса бешенства. Было продемонстрировано, что изменчивость вирулентности вируса в процессе пассажей происходит не сразу, а поэтапно, путем последовательных наследственных изменений. Так, при внутримозговом заражении кролика культурой вируса десятого пассажа инкубационный период колебался от 10 до 14 дней, после 21 пассажа он сократился до 7 – 8 дней, а штамм, выделенный после 90-го пассажа, обладал строго фиксированным инкубационным периодом (6 – 7 дней) для кролика и был авирулентным для человека. Селекционированный аттенуированный вариант был использован для иммунизации людей против бешенства. Аттенуированный штамм при подкожном введении утратил патогенность для собак и кроликов, не проникал в слюнные железы, более активно размножался в мозгу кролика, вызывая при этом менее выраженные патоморфологические изменения в ЦНС; как исключение вызывал образование телец Бабеш – Негри и, наконец, быстро инактивировался глицерином. Этими эследованиями был открыт один из методов экспериментального получения живых вакцин против вирусных болезней.
В ряде исследований показана изменчивость отдельных свойств вируса осповакцины при пассажах на животных (кроликах, телятах и других животных). Успешные опыты были проведены с вирусом желтой лихорадки, показавшие возможность значительного усиления нейровирулентности для мышей при пассажах через мозг, с одновременной утратой вирулентности для обезьян при подкожном и внутрибрюшинном введении. В процессе чередующихся подкожных и внутрибрюшинных пассажей был селекционирован авирулентный вариант для мышей, сохранивший иммуногенные свойства. После 260 пассажей селекционированный мутаген использовали для приготовления живой вакцины.
Изменчивость вирулентности и других признаков при пассажах на животных наблюдали у вирусов ящура, чумы свиней, истиной чумы птиц, болезни Ньюкасла, гриппа и др.
Изменчивость вирусов при пассажах на куриных эмбрионах.
Метод пассажей на куриных эмбрионах получил широкое распространение при изучении изменчивости многих вирусов. При пассажах вируса осповакцины отмечали усиление патогенности для куриного эмбриона и для кролика при подкожном введении. Был выведен мутант по ряду генетических признаков, сходных с вирусом натуральной оспы.
Вирус бешенства после 30 пассажей на куриных эмбрионах приобрел способность проникать во все ткани и органы зародыша, а после 75 пассажей утратил вирулентность для кролика при заражении в мозг.
При пассажах в куриных эмбрионах вируса ящура наблюдали снижение вирулентности для крупного рогатого скота, а после 120 пассажа вирус утратил не только патогенные, но и иммуногенные свойства. Пассажами в куриных эмбрионах был получен высокоиммуногенный штамм Н вируса ньюкаслской болезни, нашедший широкое применение для приготовления живой вакцины. При пассажах на утиных эмбрионах было выделено несколько вакцинных штаммов этого вируса.
Однако при длительных пассажах в куриных эмбрионах не всегда отмечали снижение вирулентности (вирусы ньюкаслской болезни, инфекционного аборта лошадей, лошадиного энцефаломиелита, западнонильского и венесуэльского энцефалитов, оспы птиц, классической чумы птиц и др.) Так, из 16 штаммов вируса чумы крупного рогатого скота только один штамм утратил вирулентность, сохранив иммуногенные свойства. Изменчивость вирусов при пассажах в куриных эмбрионах зависит от ряда условий: свойств штамма вируса, возраста эмбрионов, способа их заражения, чередования пассажей на восприимчивом животном и эмбрионе и других факторов.
Изменчивость вирусов при пассажах на культуре клеток.
Культура клеток – одна из наиболее применяемых методов для изменения вирулентности и других свойств вирусов. Широкое использование этого способа дало возможность получать наследственно измененные варианты вирусов и селекционировать их из генетически неоднородной вирусной популяции. Кроме первично трипсинизированных тканей, с этой целью широко использовали перевиваемые линии клеток. Причем отдельные клеточные линии могут быть высокочувствительными к определенным вирусам, но тем не менее в них вирус не накапливается в высоких титрах. Другие же клеточные линии, обладают пониженной чувствительности к вирусам, обеспечивает накопление их высоких концентрациях.
Используя перевиваемую или первичные культуры ткани, были выделены аттенуированные штаммы вируса классической чумы птиц. Вирулентность вируса японского инцефалита была ослаблена пассированием в культуре клеток почки Хомика с последующими пассажами на мышах–сосунках. Выделенный вариант вируса утратил вирулентность для мышей при внутримозговом заражении и не передавался комарами.
За последние годы появилось много обнадеживающих сообщений о получении стабильных вирулентных штаммов вируса ящура при пассаже на различных типах культуры тканей. После многократных пассажей в культуре тканей куриного эмбриона вируса желтой лихорадки наблюдали утрату нееротропных и висцетропных свойств для обезьян с сохранением иммуногенности. Этот вариант (штамм 17 Д) успешно используется для приготовления живой вакцины.[4]
При пассажах вируса полиомиелита в культуре почечной ткани обезьян был выделен ряд мутантов, не вызывающих у обезьян параличей при введении в головной и спиной мозг. Авирулентные штаммы были получены при быстро следующих друг за другом пассажах, благодаря чему создаются благоприятные условия для отбора вариантов, обладающих наибольшей активностью размножения. Сочетая отбор с многократными пассажами, были выделены мутанты с наследственно ослабленной нейровирулентностью для обезьян. Для снижения вирулентности необходимо было проделать 20-40т пассажей.
Изменчивость вирусов, возникающая в процессе пассажей при повышенных и пониженных температурах.
Убедительные данные об ослаблении вирулентности в процессе пассажей при пониженной температуре полученных в опытах с вирусом ящура. Вирус пассировали на первичных культурах почки телят при 37°, 28° и 22° . Вирулентность проверяли на свиньях и мышах сосунках. Как выяснилось, все авирулентные для свиней варианты не размножались в культуре клеток при 40°. В то же время вирулентные и авирулентные штаммы одинаково активно размножались при 28°, а при 22° активно репродуцировались только авирулентные варианты. Однако не у всех авирулентных для свиней штаммов оптимум температуры размножения был ниже 37°. Отдельные варианты более активно размножались при 37° и не размножались при 22°. Таким образом, не во всех случаях ослабление вирулентности для свиней и мышей сопровождалось изменением активности репродукции при пониженных температурах, что не дает основания считать основание абсолютной взаимосвязи у ящура между вирулентностью и активностью репродукции при пониженной и пониженной температурах.
В ряде наблюдений была так же показана возможность получение авирулентных вариантов у других вирусов в процессе пассажа их при пониженных температурах (гриппа, чумы свиней, полиомиелита, кори, японского энцефалита и др.). Так, при пассажах вирусах гриппа на куриных эмбрионах при пониженных (32-25°С) температурах были селекционированые мутанты, более активно размножающие при 28° и 32°, чем при 36°. У них закономерно наблюдалось ослабление или утрата вирулентности и токсических свойств. И, наоборот, мутанты селекционированные в процессе пассажей при повышенных температурах, более активно размножались при 39° и 41°, чем исходные штаммы. Варианты утратили свойства размножаться при 25-28°С.
Сходные результаты были получены в опытах с другими видами вирусов. На основании проведенных исследований можно сделать выводы, что пассажи вирусов при пониженных температурах, как правило, приводили к появлению вариантов с ослабленной вирулентностью. Снижение или полная утрата ее в ряде случаев коррелировали с утратой способности размножаться при повышенных температурах.
Причина изменчивости вирусов при пассажах еще мало выяснены. Согласно селекционной теории, культура вируса генетически не однородна и в процессе пассажей на животных или культуре клеток происходит отбор и накопление вариантов для которого данное условие культивирование более благоприятно. Другая возможная причина возникновения вариантов при пассажах - рекомбинация вирусов.[5]
Изменчивость вирусов при пассажах принципиально не отличается от мутации, возникающих при воздействии физическими и химическими мутогенами, так как в обоих случаях изменения признаков у вируса связаны с изменениями в его генотипе. Различия между ними несущественные, главным образом количественные. Одна из особенностей изменчивости при пассажах состоит в том, что для изменения генетических признаков, особенно таких сложных полигинных признаков, как патогенность или репродуктивная активность, требуется ряд мутаций, возникающих в серии пассажей. Такого типа многоступенчатые мутации являются отражением процесса перехода количественных изменений в качественные. Следует при этом отметить, что изменения свойств у вирусов при пассажах возникают раньше, чем мы их обнаруживаем. С момента появления первых изменений до выявления их проходит, какой то период количественных изменений, которые на каком то этапе пассажей переходит в качественные, существенно изменяющие наследственные признаки вируса.
Химические мутагены
Предложено три классификации химических мутагенов:
Рехборна, Фриза, Раппопорта.
Фриз предложил разделить мутагены на две основные группы:
1) мутагены, реагирующие с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации;
2) мутагены, вступающие в реакцию с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты, но требующие для формирования мутащий последующих ее репликаций.
В основе молекулярных изменений вирусной нуклеиновой кислоты, приводящих к мутации, лежат два основных процесса: замена основания или вставка основания. Различают два типа замены оснований: простую (транзиция) – на место одного пуринового основания встает другое или одно пиримидиновое основание заменяется другим; сложную (трансверсия) – вместо пуринового основания появляется пиримидиновое или пиримидиновое основание заменяется пуриновым. Вставка основания – ведет более к глубоким изменениям генетического кода, чем простая замена оснований. В то же время основой изменения генетического признака, имеющего одно и то же фенотипическое выражение, могут быть мутационные повреждения различных генов.
Кроме простых замен, алкилирующие агенты способны индуцировать сложные замены – пурин на пиримидин. Мутагенное действие этих соединений было показано с вирусами ньюкаслской болезни и клещевого энцефалита.
Гидроксиламин индуцирует мутации по типу образования простых замен оснований в нуклеиновой кислоте, направление которых зависит от типа нуклеиновой кислоты, которую содержит вирус. С помощью гидроксиламина были индуцированы мутации у вирусов герпеса, ньюкаслской болезни, полиомиелита.
В последнее время был синтезированный и изучен один из аналогов гидроксиламина оксиметилгидроксиламин (ОМГА), реагирующий только с цитозином, но не с урацилом РНК, а следовательно, обладающий более высокой специфичностью и одной направленностью мутагенного действия.
Для вирусов человека и животных мутагеном является и формальдегид, с помощью которого были индуцированы мутанты у вируса полиомиелита и вируса западного энцефаломиелиталошадей при воздействии на очищенную РНК и внутриклеточный вирус. Механизм мутагенного действия формальдегида недостаточно изучен.
Механизм действия азотистой кислоты (НNО2) как мутагена на нуклеиновые кислоты заключается в дезаминировании органических оснований, т. е. отщепление от их молекул аминогруппы (NH2).
Физические мутагены
Мутагенное действие ультрафиолетового излучения. Действие УФ лучей как мутагенов состоит в том, что они взаимодействуют с молекулами нуклеиновых кислот и поглощаются ими, особенно лучи с длинной волны 260 – 280 нм. Попадая в молекулу нуклеиновой кислоты, они поглощаются входящими в ее состав органическими основаниями. Оказалось, что тимин, урацил, цитозин более чувствительны к ультрафиолетовым лучам, чем аденин и гуанин. При облучении УФ-лучами две соседние молекулы тиминов соединяются друг с другом в пары, образуя так называемые тиминовые димеры.
Под влиянием УФ-облучения получен мелкобляшечный мутант вируса западного лошадиного энцефаломиелита, обладающий стабильным S-фенотипом в культуре клеток ФКЭ. Установлена принципиальная возможность получения мутаций при воздействии УФ-лучей на репродуцирующийся вирус и его нуклеиновую кислоту, в которой происходят структурные нарушения РНК: компонент ее – урацил образует диаметр и гидраты.
Заключение
Не все мутации, образующиеся под влиянием мутагенов, одинаково стабильны. Мутанты, полученные при действии повышенной температуры, кислой среды, ультрафиолетовых лучей и ультразвуковых волн, давали около 20% реверсий, при воздействии профлавина все мутанты оказались полностью стабильными. Эти различия в стабильности связаны с неодинаковым молекулярным механизмом действия использованных мутагенов. Повышенная температура, кислая среда, ультрафиолетовые лучи вызывают главным образом локальные изменения вирусной нуклеиновой кислоты, ведущие к замене отдельных оснований. При мутагенном действии профламина, а также частично азотистой кислоты причиной мутаций являются выпадения или вставки оснований. При получении вакцинных вирусных штаммов путем воздействия на вирус мутагенами целесообразно использовать мутагены, вызывающие более глубокие изменения генетического кода – типа выпадений или вставок, так как такие мутанты обладают стабильностью наследственных свойств.
Эволюция вирусов в природе идет в различных направлениях, т. е. изменение патогенности вируса, спектра патогенности, антигенные, иммуногенные свойства вирусов и т. д. Эволюция разных видов имеет свои особенности. Одно из важных изменений, это изменение круга хозяев, приспособление к бактериям, грибам, насекомым, растениям.
Список литературы:
1. Сюрин В. Н. Ветеринарная вирусология. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1991. 431 с., с ил.
2. Горьский Б. В. И др. Основы общей ветеринарной вирусологии. 2-е изд., М., «Колос», 1978., 192 с., с ил.
3. Гендон Ю. З. Общая и частная вирусология. – М.: Мир, 1981. – 680 с., с ил.
4. Земсков М. В. И др. Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии. – 2-е изд., испр. и доп. М., «Колос», 1977., 312 с., с ил.
5. Под редакцией Сюрина В. Н. Руководство по ветеринарной вирусологии. – М., «Колос», 1966., 686с.
