Быстрый поиск

Реферат: Молекулярно-генетичні маркери раку молочної залози у осіб різних вікових груп

За результатами клініко-генеалогічного аналізу, сімейні випадки захворювання родичів І та ІІ ступеню спорідненості на рак молочної залози (СРМЗ) становили 32,1% у пацієнток з Ірану (рис.2) та 28,6% – з України.

Як було показано вище, ризик розвитку захворювання на РМЗ в загальній популяції збільшується з віком, в той час як для сімейних випадків РМЗ максимальні величини відносного ризику було виявлено нами у віковій групі до 55 років (табл.2). Коефіцієнт RR для жінок до 35 років у 2 рази перевищує такий у порівнянні з особами старше 76 років.

Використання патологоанатомічного архівного матеріалу, який зберігається в блоках, пов’язане з дедалі більш частою потребою ретроспективного аналізу молекулярно-генетичних маркерів. Стандартні методи виділення ДНК з матеріалу гістологічних зрізів пухлин молочної залози, як застосовувались на початку нашої роботи, давали високий відсоток деградовано ДНК, що обмежувало можливості використання гістологічних зрізів тканин пухлин для дослідження молекулярно-генетичних маркерів, що було основною метою роботи.

Для вибору оптимального методу видалення парафіну та оцінки ефективності подальшої реакції ампліфікації було використано 20 зразків гістологічних зрізів товщиною 20 мкм пухлин молочної залози жінок, які були прооперовані з приводу РМЗ. Зрізи розміщували у мікроцентрифужн пробірки, додавали 200 мл буферного розчину (тріс-HCl, pН 9,0, 0,5% Тween-20), паралельно проводили різні процедури видалення парафіну:

1) нагріванням зразка у мікрохвильовій печі протягом 45-60 сек. при потужності 650 w,

2) нагріванням зразка в автоклаві протягом 20 хвилин при температурі 120 °C,

3) експозицією зразка у ксилолі протягом 30, 60 і 120 хвилин (стандартний метод).

Для виділення ДНК після депарафінізації зрізів використовували два варіанти інкубації матеріалу з протеїназою К :

1) при 37 °С протягом 12 годин,

2) при 57 °С протягом 3 годин.

При порівнянн ефективності виділення ДНК з гістологічних зрізів різними методами найкращ результати ПЛР було отримано при поєднанні способу видалення парафіну нагріванням в мікрохвильовій печі з інкубацією тканини при температурі 57 °С (табл. 3).

При порівнянн кількості позитивних результатів ампліфікації генів BRCA 1/2 позитивний результат ПЛР виявлено у 70% випадків (14 з 20).Різниця ефективності склала 35% (P <0,03).

Вибір можливих молекулярно-генетичних маркерів для визначення ризику розвитку РМЗ базувався на відомостях про значну роль мутацій в генах BRCA 1 та BRCA 2 у виникненні цієї патології. Були вибрані мутації 5382insС, 185delAG в гені ВRCA1 мутація 6174delT в гені ВRCA2, що визнані мажорними для європейських популяцій.

При молекулярно-генетичному обстеженні 120 хворих на РМЗ з України мутації в генах BRCA 1 та BRCA 2 були виявлені у 13 жінок (11,40%). У 10 пацієнток була виявлена мутація 5382ins у гені BRCA 1 (8,33%), у 2 пацієнток з 45 проведених обстежень – мутація 185delAG у гені BRCA 1 (4,44%), у 1 пацієнтки з 49 проведених обстежень – мутація 6174delТ у гені BRCA 2 (2,04%). При вивченні розподілу пацієнток - носіїв мутацій у генах BRCA по віку максимальне число мутацій було виявлено у віковій групі 31-40 років. Це відповідає літературним даним про те, що для BRCA-асоційованих форм злоякісних пухлин характерним є ранній вік початку захворювання [Billack B., Monteiro A., 2005].

При молекулярно-генетичному обстеженні 120 хворих на РМЗ з України мутації в генах BRCA 1 та BRCA 2 були виявлені у 13 жінок (11,40%). У 10 пацієнток була виявлена мутація 5382ins у гені BRCA 1 (8,33%), у 2 пацієнток з 45 проведених обстежень мутація 185delAG у гені BRCA 1 (4,44%), у 1 пацієнтки з 49 проведених обстежень – мутація 6174delТ у гені BRCA 2 (2,04%). При вивченні розподілу пацієнток - носіїв мутацій у генах BRCA по віку максимальне число мутацій було виявлено у віковій групі 31-40 років. Це відповідає літературним даним про те, що для BRCA-асоційованих форм злоякісних пухлин характерним є ранній вік початку захворювання [Billack B., Monteiro A., 2005].

Висновок про те, що наявність мутацій у генах BRCA, може бути використане як молекулярно-генетичний маркер ризику розвитку РМЗ для жінок молодого віку, підтверджує і розрахунок відносного ризику розвитку РМЗ у осіб, що мають мутації у генах BRCA (рис.3). Представлена на рисунку 3 діаграма показу зменшення значень коефіцієнту RR з віком жінок з РМЗ при наявності мутантних алелів генів BRCA, на противагу найбільшим значенням відносного ризику у осіб старших вікових груп при урахуванні лише вікової характеристики пацієнток (рис.2).

3 з 34 (9%) обстежених молекулярно-генетичними методами пацієнток з РМЗ із Ірану була виявлена мутація 5382insС у гені BRCA 1 (рис.4). При цьому ні в одному випадку мутація 5382insС не була виявлена у осіб з несімейним РМЗ, а частота цієї мутації в групі сімейного РМЗ склала 19%. Вік пацієнток, що мали мутацію в гені BRCA, також не перевищував 45 років. Мутації 185delAG в гені ВRCA1 і 6174delT в ген ВRCA2 не були знайдені ні в одному випадку.

У 69,6% з 120 обстежених українських пацієнток з РМЗ при дослідженні імуногістохімічних маркерів були виявлені рецептори естрогену, у 60% – рецептори прогестерону. При цьому з 13 жінок – носіїв мутацій в генах BRCA1/2 рецептори естрогену та прогестерону в тканині пухлини були виявлені лише в 21,43% зразків, а в груп померлих пацієнток рецептори естрогену було виявлено в 5,8% випадків, рецептори прогестерону – в 11,8% випадків.

Відсутність досліджуваних рецепторів в пухлинах молочної залози, за даними літератури (Lakhani S.R. et al., 2002, Eerola H. et al., 2005, Chen S., 2006) характерні для жінок, що мають мутації в генах BRCA1/2, і за думкою багатьох спеціалістів є ознакою несприятливого прогнозу.

Наявність рецепторів естрогену було виявлено у 15 з 34 (44,1%) обстежених іранських жінок, що хворіють на РМЗ, рецептори прогестерону – у 17 (50%). Низька частота виявлення рецепторів естрогену/прогестерону у пухлинах молочної залози у жінок з Ірану, можливо, пов’язана з малою вибіркою. В той же час слід зазначити, що наявність рецепторів була встановлена в декілька разів частіше у пацієнток з несімейним РМЗ (рецептори естрогену – 61% проти 25% при сімейній формі, рецептори прогестерону - 67% та 31%, відповідно).

У розвитку пухлин значну роль відіграє процес накопичення мутацій, котрі виникають як у ядерній, так і у мітохондріальній ДНК. Дослідженнями останніх років показано, що при різних видах пухлин, в тому числі і при РМЗ, з високою частотою виявляють мутації мтДНК. Роль мітохондріальних мутацій в процесі онкогенезу на сьогоднішній день вивчена недостатньо. Проте не підлягає сумніву той факт, що порушення функцій мітохондрій внаслідок високої частоти мутацій, які виникають в мітохондріальному геномі, не репаруються і накопичуються, не можуть не вплинути на стан клітин і тканин. . Тому поглиблене вивчення мітохондріальних мутацій як ранніх маркерів пошкодження клітин на молекулярному рівні основане на необхідності виявлення начальних етапів патологічного процесу.При дослідженні наявност делеції мтДНК4977 в мітохондріальній ДНК результати ПЦР було виявлено у всіх 47 зразках – 9 з крові, 34 – з тканини пухлини. При дослідженні 9 зразків кров пацієнтів з РМЗ була виявлена делеція мтДНК4977 в 5 препаратах ДНК (56%), в тканин пухлини від цих же пацієнток мутація в мтДНК виявлена не була (рис.5). В 34 зразках ДНК з гістологічних зрізів мутація мтДНК4977 не була виявлена ні в одному випадку.

Розроблено діагностичний алгоритм, який дозволяє визначати ступінь ризику виникнення РМЗ за допомогою поетапного проведення клініко-генеалогічного та молекулярно-генетичного досліджень. Цей алгоритм суттєво покращить ефективність медико-генетичного консультування.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і вирішення наукового завдання, що полягає у підвищенні ефективності визначення ризику розвитку раку молочно залози для жінок різних вікових груп на основі визначення молекулярно-генетичних маркерів спадкової схильності та сімейного характеру захворювання. Для визначення ступеню ризику виникнення раку молочної залози запропоновано діагностичний алгоритм.

1. Сімейн випадки захворювання родичів І та ІІ ступеню спорідненості на рак молочно залози склали 32,1% у пацієнток з Ірану і 28,6% - з України.

2. Відносний ризик розвитку захворювання раком молочної залози в загальній популяції плавно збільшується з віком, досягаючи максимуму в групах жінок після 55 років, тод як для сімейних випадків раку молочної залози навпаки, максимальні величини коефіцієнту відносного ризику виявляються у віковій групі до 30 років і в 2 рази перевищують такий у осіб старше 75 років.

3. Для молекулярно-генетичних досліджень матеріалу з гістологічних зрізів тканини пухлини молочної залози найбільш ефективним методом видалення парафіну виявилось нагрівання в мікрохвильовій печі, що у поєднанні з виділенням ДНК з використанням інкубації тканини пухлини з протеїназою K при t +57 °С на протяз 3 годин, дозволило досягти найбільшої кількості (70%) позитивних результатів ампліфікації генів BRCA 1/2.

4. Найбільш поширеною мутацією в гені ВRCA1 є мутація 5382 insС в 20 екзон складає в Україні 9,2%, в Ірані - 8,8%. Дві інші мутації (185delAG в гені ВRCA1 6174delT в гені ВRCA2) були виявлені тільки у хворих раком молочно залози з України (4,44% і 2,1% відповідно). Значне зростання коефіцієнту відносного ризику розвитку раку молочної залози у жінок молодших вікових груп до 50 років при наявності мутацій у генах ВRCA1/2 у порівнянні з високими значеннями показника відносного ризику для пацієнток старших 50 років при урахуванні лише віку пацієнток доводить можливість використання наявност мутацій у генах BRCA у якості молекулярно-генетичний маркеру високого ризику розвитку раку молочної залози для жінок молодшого віку.

5. Делеція мітохондріальної ДНК мтДНК4977 була виявлена в 56% зразків крові пацієнток з раком молочної залози з Ірану, в тканинах пухлин молочної залози мутація мтДНК4977 не була виявлена ні в одному випадку.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. При проведенні молекулярно-генетичних досліджень мутацій в генах BRCA1/2 у тканині гістологічних зрізів пухлин молочної залози найкращі результати ПЛР можуть бути отримані при поєднанні способу видалення парафіну нагріванням в мікрохвильовій печі при потужності 650 w протягом 45-60 сек. та виділення ДНК з інкубацією тканини тривалістю 3 години при температурі 57єС .

2. Для оцінки ступеню ризику виникнення раку молочної залози у індивіда першим етапом дослідження повинен бути клініко-генеалогічний аналіз із виявленням повторних випадків захворювання родичів І та ІІ ступеню спорідненості.

3. При наявності повторних випадків захворювання на рак молочної залози родичів І та ІІ ступеню спорідненості слід проводити молекулярно-генетичне дослідження генів BRCA1/2 за допомогою мультиплексної ПЛР у пацієнток з РМЗ для виявлення молекулярно-генетичних маркерів ризику виникненя РМЗ – мутацій 5382ins та 185delAG у гені BRCA 1, мутації 6174delТ – у гені BRCA 2.

4. При виявленні мутацій у генах BRCA1/2 потрібно аналізувати наявність мутації мтДНК4977 в препаратах ДНК з периферичної крові.

5. Виявлення мутацій в генах ВRCA1/2 і мутації мтДНК4977дає можливість оцінити ступінь ризику виникнення РМЗ для осіб з родин, обтяжених цією патологією.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Расси Х. Сравнительная оценка способов выделения ДНК из гистологических срезов опухолей молочной железы // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики: Зб. наук. праць. Вип. 14. – Київ-Луганськ, 2007. - С. 282-288.

Внесок здобувача: проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз медичної документації, статистична обробка результатів, формулювання висновків, написання статті.

2. Расси Х., Хошманд М., Хашеми М., Маджидэаде К., Хоссеини Акбари М.Х. Молекулярно-генетический анализ делеции МтДНК4977 в прогнозе развития наследственного рака молочной железы // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2007. - Т.7.- № 2. - С. 38-42.

3. Довженко С.П., Расси Х., Захарцева Л.М., Подольская С.В., Мясоедов Д.В., Горовенко Н.Г. Некоторые факторы риска развития рака молочной железы и прогноза течения заболевания у пациенток из Украины // Лікарська справа. - 2007. - № 7. - С. 61-64.

4. Расси Х. Клинико-генетические аспекты рака молочной железы: этиопатогенез, профилактика, лабораторные методы // Збірник наукових праць співробітників НМАПО імені П.Л. Шупика. Вип. 16. Книга 1. – Київ, 2007. - С. 20-30.

5. Rassi H. Diagnosis of familial breast cancer by multiplex PCR and clinical parameters // Breast Cancer Research. - 2007. - Vol. 9. - Suppl. 1. – P. 21.

6. Rassi Hossein. The relation between Estrogen and mitochondrial genome in hereditary breast cancer // Acta Biochimica Polonica. - 2007. - Vol. 45. - Suppl. 5. - P. 35.

7. Расси Х. Изучение частоты мутаций в генах ВRCA1 и BRCA2 у лиц с раком молочной железы из Ирана // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю «Актуальні питання медичної генетики». – Київ, 2007. - С. 107-108.

8. Расси Х. Изучение частоты мутации мтДНК4977 в тканях пациенток из Ирана с раком молочной железы. VIII Конференция молодых онкологов с международым участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии»: Сборник тез. – Киев, 2007. - С. 65.

9. Rassi H., Houshmand M. and Gorovenko N.G. Practical aspects in breast cancer tumors for mutation detection // Abstract Book 17th International Congress on Anti-Cancer Treatment. Paris, France (Jan 30 – Feb 2), 2006. – P. 184.

10. Rassi H. and Houshmand M. Investigation of three founder mutations in BRCA1 and BRCA2 in Iranian breast cancer patients // Acta Biochimica Polonica. - 2007. - Vol. 45. - Suppl. 5. – P. 49.

АНОТАЦІЯ

Pассі Xоссейн. Молекулярно-генетичн маркери раку молочної залози у осіб різних вікових груп.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика.- Науковий центр радіаційно медицини АМН України, Київ, 2008.

Дисертаційна робота присвячена визначенню можливості використання мутацій в генах ВRCA1, ВRCA2 та мітохондріальній ДНК у якост молекулярно-генетичних маркерів ризику виникнення раку молочної залози у осіб різних вікових груп з Ірану і України.

В роботі вперше досліджена поширеність сімейного та несімейного раку молочної залози у жінок з Ірану. Як в Україні, в Ірані були відмічен аналогічні рівні зростання частоти захворюваності жінок старших вікових груп. Розраховано дані про частоту мутації 5382insC і 185delAG в гені BRCA1 та 6174delT в гені BRCA2 у хворих на рак молочної залози з Ірану та України.

Показано, що мутації мтДНК4977 можуть виступати в якост молекулярно-генетичних маркерів, які слід використовувати при визначенн ступеня спадкової схильності до РМЗ. Встановлена вірогідна асоціація досліджуваних молекулярно-генетичних маркерів з виникненням РМЗ у осіб різних вікових груп.

Ключов слова: рак молочної залози, молекулярно-генетичні маркери, мутацій в генах ВRCA1, ВRCA2, делеція мтДНК4977, сімейний аналіз, фактори ризику.

АННОТАЦИЯ

Расси Хоссейн. Молекулярно-генетические маркеры рака молочной железы у лиц разных возрастных групп. –Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 генетика.- Научный центр радиационной медицины АМН Украины, Киев, 2008.

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее частым видом злокачественных опухолей у женщин. Развитие опухолей связано с накоплением мутаций, которые возникают как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК (мтДНК).

Целью настоящей работы было изучение частоты распространения мутаций BRCA1/2, мутаций мтДНК, и связи их с некоторыми биологическими свойствами опухоли у лиц с раком молочной железы.

В исследование были включены 84 пациентки с РМЖ из Ирана и 120 из Украины. Для выделения ДНК из тканей опухолей, зафиксированных в парафиновых блоках, готовили срезы.

В Иране мутация 5382insC была выявлена в 3 из 34 препаратах ДНК, что составило 9%.

При этом ни в одном случае мутация 5382insC не была выявлена у лиц с несемейным РМЖ, а частота этой мутации в группе семейного РМЖ составила 19%. Мутации 185delAG в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2 не были найдены ни в одном случае. При исследовании 120 пациенток с РМЖ из Украина была выявлена мутация 5382insC в 11 препаратах ДНК (9%).

Мутация 185delAG в гене BRCA1 была выявлена в 2 из 45 случаев (4,44%).

Мутации 6174delT в гене BRCA2 была выявлена в 1 случае из 49 исследуемых образцов (2,1%). Семейные случаи рака молочной железы составили 32,1% у пациенток из Ирана и 28,6% - из Украины.

Относительный риск развития заболевания раком молочной железы в общей популяции увеличивается с возрастом, достигая максимума в группе женщин 61-69 лет. Мутация 5382insC в гене BRCA1 может выступать фактором риска развития несемейного рака в Иране и в Украине у женщин моложе 50 лет. Определение мутации мтДНК4977 в препаратах ДНК из периферической крови может быть использовано как один из факторов прогноза риска развития НРМЖ. В основании полученных результатов разработан диагностический алгоритм, который позволяет выявить степень предрасположенности к НРМЖ с помощью специфических клинических обследований и молекулярной диагностики.

Ключевые слова: рак молочной железы, молекулярно-генетические маркеры, мутации в генах ВRCA1, ВRCA2, делеция мтДНК4977, семейный анализ, факторы риска.

ANNOTATION

Rassi Hossein. Molecular genetic markers of breast cancer in patients with different age groups Manuscript.

Thesis for biological science candidate degree on the speciality 03.00.15 – genetics.- Scientific Center for Radiation Medicine of the AMS of Ukraine, Kiev, 2008.

The main goal of dissertation was to study the frequency of BRCA mutation, mtDNA4977 deletion and several morphological and immunohistochemical parameters in Iranians and Ukrainians breast cancers patients.

The proportion of cases with one of BRCA mutations (5382insC) was 8,8 % in Iranian breast cancer patients and 9,2% in Ukrainian breast cancer patients. Frequency of 185delAG and 6174delT were respectively 4,44% and 2,1% in Ukrainian breast cancer patients. Frequency of familial breast cancer was 32,1% for Iranian breast cancer patients and 28,6% for Ukrainian breast cancer patients. The mtDNA4977 deletion was highly prevalent in peripheral blood (56%), but it was absent in the breast tissue of cancer cases.

Our analysis shows that testing of mtDNA4977 deletions and 5382insC in combination with morphological and immunohistochemical parameters may be effective and inexpensive tool in testing breast cancer. We developed and introduced into clinical practice a diagnostic algorithm targeted at active identification of hereditary breast cancer by diagnosis of three BRCA mutation, mitochondrial common deletion and clinical parameters.

Key Words: вreast cancer, molecular-genetic markers, ВRCA1, ВRCA2 gene mutations, deletion mtDNA4977, familial analysis, risk factiors.

Страницы: 1, 2

Меню

Быстрый поиск

Реферат: Молекулярно-генетичні маркери раку молочної залози у осіб різних вікових груп

Новости

Быстрый поиск

Группа вКонтакте: новости

Новости в Twitter и Facebook

Новости

Обратная связь