Реферат: Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов

2.4 Метод черных бляшек

Этот метод может быть использован для идентификации любых вирусов. Однако особенно удобен он оказался для CMV, образующего бляшки малого размера.

1. Культуры, достигшие монослоя, инфицируют обычным способом.

2. Через 6–7 дней после заражения удаляют КМЦ и клетки трижды промывают PBS. Затем в течение 5 мин клетки фиксируют 0,25%-ным раствором глутарового альдегида в PBS.

3. Отмыв фиксатор с помощью PBS, добавляют соответственно разведенную антисыворотку или моноклональные антитела против CMV. Клетки оставляют при комнатной температуре на 2 ч.

4. Клетки отмывают от антител PBS и инкубируют 3 ч при комнатной температуре со вторыми, обычно конъюгированными с пероксидазой хрена антителами против первых антител.

5. После трехкратной промывки в PBS в каждую культуру добавляют субстрат Hanker-Yates, 50 мл 0,1 M трис-HCl, pH 7,5, и 0,5 мл 1%-ной H202). Окраска проявляется в течение 5–30 мин.

6. Чашки промывают дистиллированной водой, переворачивают и дают им высохнуть в темноте. Темноокрашенные бляшки вируса идентифицируют и подсчитывают.

2.5 Культивирование и очистка CMV

1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, культуры заражают вирусом.

2. По окончании адсорбции культуральную среду заменяют свежей, содержащей 2% ЭТС. Инфицированные клетки культивируют при 37°С.

3. При необходимости через 48 ч после заражения культуральную среду заменяют средой, содержащей радиоактивную метку. Например, средой с 2% ЭТС и 1 мкКи/мл – метионина или же средой с 2% ЭТС и 2 мкКи/мл – аминокислот.

4. Первые признаки ЦПД проявляются через 3 дня после инфекции. Затем ЦПД становится более явным, и на 7–10 день после инфекции клетки открепляются от субстрата. Вирус следует собирать именно на этой стадии. Для получения нуклеокапсидов клетки собирают несколько раньше.

Обычно для иммунологических исследований или иммунизации животных мы выделяем CMV из культуральной среды, как описано выше для ВПГ. Однако для анализа спектров вирусных белков и т.д. специалисты рекомендуют использовать метод доктора В. Гибсона, который приводится ниже. Исходным материалом для получения вирусных препаратов максимальной инфекционности и наибольшей чистоты должна быть культуральная среда. Для сохранения высокой инфекционности препарата и целостности вирусных частиц следует избегать осаждения вируса. Впервые центрифугирование в отрицательном градиенте вязкости и положительном градиенте плотности, предложенное Барзилаи и др. для выделения CMV, было применено Тэлботом и Алмейдиа. Метод надежен и гарантирует высокую эффективность. Его осуществляют следующим образом:

1. Клетки собирают в культуральную среду, центрифугируют 10 мин при 1500 g и 4°С, затем наслаивают 3 мл супернатанта на 9 мл градиента 30% глицерина – 35% тартрата. Градиенты готовят согласно.

2. Градиент центрифугируют 20 мин при 40000 об/мин и 4°С в роторе SW41. После центрифугирования по светорассеянию, как правило, обнаруживают три фракции: неинфекционные оболочечные частицы, вирионы и плотные частицы. Вирусные частицы каждой фракции могут быть суспендированы в буфере и при необходимости повторно очищены в таком же градиенте.

Гибсон предлагает ряд модификаций этого метода, которые успешно применяются в его лаборатории.

1. Градиенты общим объемом 18 мл готовят в 38-мл пробирках для ротора SW27. На градиент наслаивают 20 мл осветленной культуральной среды и центрифугируют 40 мин при 25000 об/мин и 4°С в роторе SW27.

2. При необходимости обычно используемый буфер трис-НС1 заменяют на 0,04 М фосфатный буфер, рН 7,4.

3. Заменяют тартрат калия на тартрат натрия, если соль калия мешает последующему анализу. Натриевая соль менее растворима при 4°С, чем калиевая.

4. При необходимости вместо тартрата можно использовать градиенты сахарозы. Условия центрифугирования те же.

2.6 Типы частиц CMV

На рис. 10 представлены электронные микрофотографии частиц CMV различной морфологии, полученные методом негативного контрастирования. Спектры структурных полипептидов этих частиц, полученные электрофорезом в полиакриламидном геле, показаны на рис. 11.

2.6.1 Неинфекционные оболочечные частицы

Аймайер и Гибсон провели детальный анализ характерных признаков данных частиц. Несмотря на их сходство по внешнему виду и белковому составу со стандартными вирионами, они не содержат ДНК и, следовательно, неинфекционны.

2.6.2 Частицы высокой плотности

Структура и состав подобных частиц проще, чем неинфекционных оболочечных и стандартных вирионов. Эти частицы представляют собой большие плотные сферы, заполненные гомогенным материалом и окруженные внешней мембраной. Они не содержат ДНК., и 90% всего их белка приходится на матриксный белок, имеющий мол. массу 69 кД.

2.6.3 Вирионы

Гибсон опубликовал подробные спектры структурных белков многих штаммов CMV человека и сравнил их с CMV обезьян. Эти данные представлены на рис. 12 и в табл. 3.

3. Герпесвирус саймири

Герпесвирус саймири можно выделить из крови и культуры клеток большинства здоровых обезьян саймири. Для своих природных хозяев этот вирус не патогенен. Однако он стал предметом пристального внимания ученых после того, как была продемонстрирована его высокая онкогенность для тканей других приматов, в особенности мармозеток из рода Saguinus. У последних в течение 2 мес после заражения развиваются злокачественные опухоли лимфатической системы. Показано, что герпесвирус саймири относится к f-субгруппе герпесвирусов.

3.1 Получение заготовок вируса

Из большого количества проанализированных клеточных культур для литической инфекции и роста различных штаммов HVS наиболее пригодной оказалась линия клеток почки обезьян дурукули. Кроме того, за небольшим исключением, для получения заготовок HVS можно использовать и клетки линии Vero. Клетки ОМК можно выращивать на большинстве культуральных сред с добавлением ТС.

Для получения заготовок вируса клетки ОМК, растущие в роллерных флаконах, заражают вирусом и культивируют 4–5 дней при 37°С. Оптимальная температура культивирования – 34°С. Однако культивирование при этой температуре может привести к возникновению температурно-чувствительных мутантов. ЦПД проявляется в образовании шарообразных агрегатов клеток, не являющихся истинными синцитиями.

Как правило, ЦПД удается обнаружить на 4–5 день после заражения, хотя эти сроки могут варьировать для различных штаммов. Дочерние вирусы высвобождаются в культуральную среду, при этом в 50 мл среды одного роллерного флакона содержится примерно 2–106–2-107 БОЕ/мл. Вирусную суспензию с таким титром следует хранить при –70°С, кроме того, вирус можно предварительно сконцентрировать осаждением. Осажденный вирус обычно характеризуют отношением числа физических частиц к инфекционным. Для штамма HVS 11 данное отношение составляет 200–500, этот штамм на редкость стабилен при 4°С. Он теряет за месяц при хранении в культуральной среде всего лишь 0,51g инфекционности.

Таблица 3. Характерные особенности белков CMV

Сходные белки различных штаммов CMV				Природа белков	Характеристики
Colburn	CSG	RCMV	HCMV 751
205	205	207	212	Высокомолекулярный белок	Самый большой белок вириона
163	263	-	145	Кислый гликопротеин	Кислый гликозилированный белок
145	143	150	153	Основной белок капсида	Главный, структурный белок капсида
129	129	129	140		Белок отсутствует
119	114	100	149	Щелочной фосфопротеин	Мажорный фосфорили-рованный, щелочной белок
119	н. о.	н. о.	–	GP119	Гликозилированный, кислый
112	112	112	115		Белок вириона
100	н. о.	н. о.	–	GP100	Гликозилированный, кислый
94	90	92	79	Предранний	Отсутствует в вирионе, кислый, фосфорилирован
78	82	75	80		Содержится в вирионе
69 66	69 66	69 66	74 69	Белок внешнего матрикса Белок внутреннего матрикса	Мажорный белок, фосфорилирован Мажорный, фосфорилирован, локализуется
65 61	64	65	62 54 57	Гликопротеин	Мажорный, гликозилированный
	н. о.	н. о.		Гликопротеин	Гликозилированный
59	59	–		GP59, 57	Гликозилированный
51	50	51	52	ДНК-связывающий белок	Фосфорилированный, мажорный, ядерный
40	41	39	42		Белок вириоиа
38	37	39	39
37	37	38	35	Белок сборки	Мажорный, фосфорилированный, локализуется в В-капсидах

3.2 Титрование вируса

HVS в соответствующих разведениях обычно титруют на монослое клеток Vero или ОМК, растущих в 25 см2 пластиковых флаконах с плоским дном. Вирус титруют методом бляшек. Необходимо отметить, что некоторые партии телячьей сыворотки ингибируют формирование бляшек в культурах ОМК. Во избежание этого сыворотку выдерживают 30 мин при 56°С.

1. Адсорбируют аликвоты соответствующих разведений вируса объемом 1 мл 1–2 ч при 37°С.

2. Аликвоты заменяют на культуральную среду, содержащую 2% ТС и 0,5% КМЦ.

3. Через 7–10 дней инкубации при 37°С начинают формироваться мелкие бляшки. Через 14 дней диаметр бляшек достигает 2–3 мм, хотя, конечно же, данный признак специфичен для каждого штамма.

Немного раньше бляшки формируются в монослойных первичных культурах мармозеток. На рис. 13 показана морфология бляшек HVS через 6 и 9 дней после начала инфекции.

3.3 Цикл размножения

Обычно для получения кривых роста в культуры вносят вирус с высокой множественностью инфекции, а затем через короткие промежутки времени собирают вирус. Таким образом, получают кривую роста HVS. Однако интерпретировать полученные результаты следует с осторожностью. Рэн-делл и Хонес показали, что в этих условиях во многих клетках задерживается инициация вирусной репликации. Если это действительно так, то цикл размножения HVS в одной инфицированной клетке может завершиться за 18 ч.

Возможно, что репликация вируса зависит и от клеточного цикла. Эти сложные исследования велись с помощью иммунофлуоресценции на основе моноклинальных антител к антигенам зараженных клеток.

3.4 Получение очищенного вируса

1. Монослойные культуры, выращиваемые в роллерных флаконах, инфицируют с низкой множественностью инфекции, как описано выше. Через 4–5 дней вирус осаждают из культуральной среды центрифугированием при 25000 об/мин 30 мин в роторе SW27. При необходимости через 2 дня после заражения вносят радиоактивную метку.

2. Осадок ресуспендируют в соответствующем буфере. Полученную суспензию по возможности следует оставить на ночь при 4°С.

3. Суспендированный осадок наслаивают на градиент глицерина или сахарозы и центрифугируют при 19000 об/мин 20–30 мин в роторе SW27. После центрифугирования при просмотре пробирок в рассеянном свете обнаруживается одна полоса в центре градиента.

4. Фракцию, состоящую более чем на 90% из вирусных частиц, имеющих оболочку, отбирают, центрифугируют 1 ч при 25000 об/мин и ресуспендируют в соответствующем буфере.

В результате первого градиентного центрифугирования получают осадок, содержащий большое количество вируса. Осадок можно ресуспендировать и дополнительно очистить вторым градиентным центрифугированием. Фракции очищенного вируса могут быть использованы для определения концентрации белка, количества физических частиц и инфекционного титра. Для исследования вирусных частиц электрофорезом в полиакриламидном геле вирус разрушают, как описано выше для ВПГ. Спектр структурных полипептидов HVS штамма 11 показан на рис. 16.