Реферат: Антиатерогенна дія кріоконсервованої плаценти при експериментальному атеросклерозі
Реферат: Антиатерогенна дія кріоконсервованої плаценти при експериментальному атеросклерозі
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Кондаков Ігор Ігоревич
УДК: 615.361.013.85.014.41: 616.13 – 004.6
АНТИАТЕРОГЕННА ДІЯ КРІОКОНСЕРВОВАНОЇ ПЛАЦЕНТИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ АТЕРОСКЛЕРОЗІ
14.01.35 – кріомедицина
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією рукопис.
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоморфології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії, м. Харків
доктор медичних наук, професор
Шепітько Володимир Іванович, Вищій державний навчальний заклад України «Українська медична стоматологічна академія», завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава
Захист відбудеться 22.04. 2008 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.
Автореферат розісланий 21.03. 2008 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
член-кореспондент НАН України
доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Кріомедицина відноситься до галузей науки, які інтенсивно розвиваються. Це пов'язано з досягненнями кріобіології, які дозволили здійснити оборотну зупинку метаболізму в клітинах і тканинах за рахунок застосування технологічних процесів з використанням низьких температур (Грищенко В.І., 2003, 2004). У світі ведуться активні розробки способів низькотемпературного консервування біологічних об'єктів – (клітин і тканин) для їх практичного застосування, зокрема, в репаративній медицині (Farrant J., Walter C., 1977; Mazur P., 2003; Литовченко В.О., Мірошниченко О.В., 2004)
Плацентарна тканина серед інших кріоконсервованних біооб'єктів займає особливе місце. У теперішній час продовжуються дослідження властивостей кріоконсервовано плаценти, які були розпочаті з застосування її в ліофілізованному виді (Филатов В.П., 1933, Филатов С.В., 1977).
Низькі температури дозволили здійснити тривале зберігання фрагментів плаценти без значно втрати біологічних властивостей, на відміну від стерилізації при високих температурах та забезпечити ретельну перевірку біологічного матеріалу, який був призначений для застосування в клінічній практиці.
Плацента високоактивною «залозою» внутрішньої секреції з високим вмістом біологічно активних речовин і ростових факторів. Крім того, плацента виконує імунн функції за рахунок репродуктивних імуномодуляторів таких, як хоріонічний гонадотропін, хоріонічний адренокортикотропний гормон, прозапальні та протизапальні цитокіни. Плацента містить також велику кількість статевих гормонів: естрадіол, прогестерон та тестостерон. В тканин плаценти відбуваєтся синтез білків, наприклад, трансформуючий фактор росту, який сприяє процесам репарації та неоваскуляризації.
Тканина плаценти після введення в організм реципієнта здатна якийсь час здійснювати функцію "депо" різних біологічно активних речовин і впливати на патологічні процеси. В ІПКіК НАН України (Грищенко В.І., Прокопюк О.С., 1999) був розроблений метод кріоконсервування фрагментів тканини плаценти та отримані експериментальні й клінічні дані щодо ефективності їх застосування в терапії цукрового діабету, клімактеричного синдрому, генералізованого пародонтиту (Грищенко В.В., 2003, Грищенко В.І., Бобирьова Л. Є., 2003).
Існує думка, що введення кріоконсерввованих фрагментів плаценти може викликати регрес атеросклеротичного процесу (Степанов А. В, Строна В.І., 1997; Курильская Т.Е., 1999, Шепітько К.В., Гаєвський С.О., 2001).
Практика боротьби з атеросклерозом має більш ніж двовікову історію, однак профілактика й лікування цього захворювання залишаються й дотепер малоефективними. В розвинених країнах показники захворюваності, інвалідност смертності внаслідок атеросклерозу та його ускладнень, незважаючи на бурхливий розвиток медицини, досить високі, а в Україні вони посідають перше місце та в 2-4 рази вищі, ніж у країнах ЄС і світу (більш 68% від показника загальної смертності) (Лутай М.І., Дорогой А.П., 2002). На цей час основним методом боротьби з кардіоваскулярними проявами атеросклерозу є ліпід-корегуюча терапія, вона сприяє нормалізації рівня холестерину та його атерогенних фракцій у крові хворого. Незважаючи на успішні результати терапії коронарного атеросклерозу, клітинні й молекулярні механізми антиатерогенних ефектів уведення фетальних тканин дотепер залишаються актуальними.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі кріоморфології за темами: «Дослідити структурно-метаболічний і функціональний стан клітин фетоплацентарного комплексу після кріоконсервування і гіпотермічного зберігання» № 2.2.6.02 № ДР 0101U003484 та «Вивчити механізм регенераційних процесів шляхом дослідження структурних і деяких метаболічних показників організму експериментальних тварин після трансплантації плаценти в умовах атеросклерозу» № 2.26.31 № ДР 0106U002170.
Мета і задач дослідження. Мета даного дослідження – реалізація антиатерогенної дії алогенно кріоконсервованої плаценти на основні ланки атерогенезу в кролів з моделлю експериментальною атеросклерозу.
Відповідно до поставленої мети передбачалося:
Дослідити вплив введення АКП на показники ліпідного обміну у експериментальних тварин з регресом моделі експериментального атеросклерозу.
Визначити зміни рівня естрадіолу у сироватці крові тварин з регресом моделі експериментального атеросклерозу, та визначити взаємозв’язок цих показників з показниками ліпідного обміну.
Провести порівняльне планіметричне дослідження розповсюдженості осередків ліпоїдозу аорти у експериментальних тварин після введення АКП та з регресом експериментального атеросклерозу.
Вивчити вплив введення АКП на структурно - функціональний стан ендотелію аорти у експериментальних тварин з регресом експериментального атеросклерозу.
Дослідити вплив введення АКП на систему мононуклеарних фагоцитів у експериментальних тварин з регресом експериментального атеросклерозу, та визначити взаємозв’язок цих показників з показниками ліпідного обміну.
Оцінити морфологічний стан тканини міокарду після введення АКП на тлі регресу експериментального атеросклерозу.
Об’єкт дослідження: антиатерогенні ефекти дії алогенної кріоконсервованої плаценти при використанн у кролів із спонтанним регресом експериментального атеросклерозу.
Предмет дослідження: кроляча плацента, аорти, фрагменти аорт, шматочки міокарду, сироватка крові та форменні елементи крові експериментальних тварин.
Методи дослідження: Для вирішеня поставлених задач були використані кріобіологічні, біохімічні, планіметричні, гістологічні, цитологічні, гістохімічні, електронно-мікроскопічні, морфометрічні та статистичні методи.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчені й встановлені морфологічні та біохімічн прояви антиатерогенних, вазотрофічних ангіопротекторних ефектів після введення алогенної кріоконсервованої плаценти (АКП) у кролів з експериментальною моделлю атеросклерозу.
Показано, що після введення кріоконсервованої плаценти зменьшується площа атеросклеротичних уражень аорти, це повязано з інтенсивним ростом vasa vasorum та їх прорастанням у внутрішню третину середнього шару стінки аорти.
Встановлено, що використання кріоконсервованої плаценти прискорює нормалізацію ліпідного спектру сироватки крові, активізує виведення лейкоцитами атерогенних фракцій ліпопротеїдів з осередків уражень.
Доведено, що введення кріоконсервованої плаценти призводить до зниження вмісту загального холестерину (ЗХС), ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ), що викликає, у свою чергу, зменшення коефіцієнта атерогенності (КА) та сприяє прискоренному регресу експериментального атеросклерозу.
Показано, що при моделюванні атеросклерозу знижується рівень естрадіолу, а використання кріоконсервованої плаценти забезпечує його вірогідне збільшення.
Практичне значення отриманих результатів. Після введення АКП кролям з експериментальною моделлю атеросклерозу отримано дані про антиатерогенні, вазотрофічні та ангіопротекторні ефекти. Це дозволило рекомендувати випробування застосування кріоконсервованої плаценти при лікуванні хворих на атеросклероз для стабілізації й зворотного розвитку первинного й вторинного ліпоїдозу в артеріях на тлі гіполіпідемічної терапії.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно проведено аналітичний огляд літератури за темою дисертації, отримано результати експериментальних досліджень, проведено їх аналіз та статистичну обробку. Разом з науковим керівником проф. Юрченко Т.М. дисертантом були обговорені та узагальнені результати досліджень, а також сформульовані остаточні висновки. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:
- в роботах [3,8] самостійно сформована модель експериментального атеросклерозу, отримана алогенна плацента, проведено її кріоконсервування, та введення експериментальним тваринам, самостійно отримані дані, проведена їх статистична обробка.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на конференції «Нейроендокринні і імунні механізми регуляц гомеостазу в нормі та патології» (м. Запоріжжя, 2005 р), ІІ Міжнародному симпозиумі «Биоэтика - путь к мировым стандартам» (м. Харків, 2005)., ІІІ Всеросійському симпозиумі «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з яких: 5 наукових статей у спеціалізованих фахових виданнях, 3 тези доповідей на наукових конференціях.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 124 сторінках друкованого тексту, з яких 110 сторінок складає основний зміст.д.исертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків і переліку використаної літератури (148 першоджерел, розміщено на 14 сторінках). Робота люстрована 12 таблицями, 42 малюнками, з них 37 - мікрофотографії.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали й методи дослідження.
Матеріалом дослідження були 28 кролів самців породи "шиншила", вагою 3500 - 4200 г., віком 12 місяців. Тварини перебували на холестериновій дієті (Аничков Н.Н., 1913) протягом 180 діб. Експериментальних тварин розподілили на групи: І – контроль (5 тварин), ІІ - модель атеросклерозу (23 тварини) які утримували в стандартних умовах віварію. Після досягнення піка моделі (6 місяців годування холестерином) 23 тварини ІІ групи були розділені на підгрупи: 1 - спонтанний регрес експериментального атеросклерозу (10 тварин); 2 - введення АКП на тл регресу спонтанного атеросклерозу (10 тварин); 3 - пік моделі (3 тварини).
В експерименті використовували протягом 6 місяців холестерин виробництва С. Петербург, Росія, у дозі 200 мг/кг маси тіла per os за схемою: 5 днів - годування холестерином, 2 дні – відпочинок.
Після припинення навантаження холестерином спонтанний регрес, а також ефекти введення АКП на тлі регресу атеросклерозу, досліджували протягом 6 тижнів. На 6-му місяці експерименту тваринам 2-ї підгрупи введено АКП.
Плаценту для подальшого використання одержували у двох безпородних кролиць при доношеній вагітності після 4 тижнів гестації.
Для кріоконсервування із плацентарної тканини вирізали фрагменти розміром 0,8х0,8 см., вагою 550-600 мг. Перед проведенням циклу кріоконсервування фрагменти занурювали в 10% розчин ДМСО на 20 хвилин, далі їх переносили в поліамідний контейнер і заморожували за 2-етапною програмою відповідно до методичних рекомендацій (Грищенко В.І., Прокопюк О.С., 1999). Відігрівання зразків здійснювали на водяній бан при температурі 40°С.
На попередньо обробленій ділянці спини під інфільтраційною анестезією 0,5% розчину новокаїну робили розріз довжиною 3 см. та формували підшкірний карман, в який поміщали фрагменти плаценти. На шкіру накладали 2 шви та обробляли розчином брильянтового зеленого.
Через 6 тижнів після введення АКП, тварин 1-3 підгруп піддавали евтаназії відповідно до документів: Директиви 86/609 ЕЕС і угодою Ради Європи ЕТ 123. Всі експерименти проводили згідно з "Загальними етичними принципами експериментів над тваринами", схваленими Першим національним конгресом з біоетики (20 вересня 2001 р. Київ, Україна) та "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин" (1984, додаток 4).
Для проведення планіметричного, гістологічного, гістохімічного та цитологічного досліджень були виділені аорти, фрагменти аорти, шматочки міокарду та приготовлен цитологічні препарати крові експериментальних тварин.
Біохімічн методи контролю за станом ліпідного обміну та рівнем естрадіолу в сироватці крові експериментальних тварин. Для контролю за розвитком моделі атеросклерозу показники ліпідного обміну досліджували через кожні 30 діб протягом 6 місяців у І та ІІ групах. Визначали показники рівня ЗХС, тригліцеридів (ТГ) і ХС ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ). Для дослідження використовуали реактиви фірми "Lachema": для визначення рівня ЗХС - CHOL 150, бета-ліпопротеїнів - BLP 200, і ТГ - TG 50. Рівень ЛПНЩ ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) визначали за формулами:
ЛПНЩ = ЗХС - (ЛПВЩ + (ТГ/2,18));
ЛПДНЩ = ТГ/2,18.
Коефіцієнт атерогенности (КА) визначали за формулою:
КА = (ЗХС - ЛПВЩ) / ЛПВЩ (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999).
Показники ліпідного обміну на піку розвитку експериментального атеросклерозу при його регресі, а також після введення АКП на тлі регресу реєстрували щотижня протягом 3-х тижнів.
Рівень естрадіолу у сироватці крові тварин досліджували прямим твердофазним імуноферментним методом з використанням реактивів фірми DRG (Estradiol Elisa Kit). Показники рівню естрадіолу в сироватці крові визначали у тварин всіх груп та підгруп.
Статистична обробка отриманих результатів проводилася за допомогою програми Statgraph 2.0
Планіметрична оцінка частоти й поширеності осередків ліпоїдозу в інтимі аорти. Аорти виділяли від дуги до біфуркації на стегнові артерії, фіксували в нейтральному 10% розчині формаліну, після чого для проведення планіметрії забарвлювали за методом (Непряхин Г.Г., 1979). Площу осередків ліпоїдозу визначали за допомогою морфометричної програми Bіovіsіon 3.0. Фотозйомку аорт проводили цифровим фотоапаратом Olympus C 180.
Морфологічні та гістохімічні методи дослідження морфофункціонального стану міокарду, ендотелію аорти та лейкоцитів периферічної крові. Для гістохімічного дослідження шматочки аорти та міокарду заливали в парафін, гістологічні зрізи тканин забарлювали гематоксилін-еозином, пікрофуксином за методами: Ван-Гізон, Харта і Вейгерта (Пирс Э., 1962, Лилли Р., 1969).
Для морфологічного дослідження ендотелію шматочки аорти піддавали перфузії розчином глюкозо-формаліну, імпрегнували азотнокислим сріблом, проявляли в стандартному фотопроявнику й дофіксовували в 10% розчині формаліну протягом 12 годин (Кондаков І.К., 2000). Імпрегновані сріблом препарати аорти досліджували методами світлової, растрової й трансмісійної електронної мікроскопії. Враховували площу ендотеліоцитів і кількість міжендотеліальних дефектів з розрахунку на 100 клітин. Площу ендотеліоцитів визначали за допомогою морфометричної програми Bіovіsіon 3.0.
Для вивчення популяційного складу лейкоцитів крові кролів і визначення кількост «ліпіднавантажених» лейкоцитів кров забирали щотижня, готували цитологічн препарати: мазки крові висушували на повітрі, фіксували в парах формаліну забарвлювали азур-еозином (за методом Романовського), а також суданом чорним Б (за методом Ліллі-Бартнера (Лилли Р., 1969)). Популяційний склад лейкоцитів крові кролів вивчали за допомогою класифікатора (Никитин В.Н., 1949). Розподіл лейкоцитів на популяції проводили, враховуючи площу оптичного перетину лейкоцитів та їх морфологічні особливості. «Ліпіднавантажені» лейкоцити підраховували в 50 полях зору на кожному мазку, при збільшенні 400. Площу оптичного перетину досліджуваних лейкоцитів визначали за допомогою морфометричної програми Bіovіsіon 3.0., фотореєстрацію проводили цифровим фотоапаратом Olympus C 180.
