Курсовая работа: Виготовлення лікарських препаратів на основі амілолітичних ферментів
- Ветеринарн препарати для тварин (Ветом 1.1, Ветом 2, Ветом 3, Ветом 4, гінекологічн свічки Ветомгін, порошок Комарова, мазь Біосептін та ін);
- Добрива для рослин (порошок Фітоп-Флора-С).
Основн виробничі та лабораторні площі розташовані в наукогради Кольцово, Новосибірської області на території Державного наукового центру вірусології та біотехнології «Вектор» - одного з найбільших у світі науково-виробничих комплексів, основними напрямками діяльності якого є проведення фундаментальних прикладних досліджень в галузі медицини, ветеринарії та сільського господарства. Фірма скористалася природним для природи шляхом підтримки здоров'я макроорганізму, а саме - з природного середовища виділили бактерії - сапрофіти, що мають властивість пригнічувати ріст і розвиток патогенної, умовно-патогенної і гнильної мікрофлори, в тому числі і в шлунково-кишковому тракті теплокровних. Деякі з використовуваних нами штамів бактерій модифікован таким чином, щоб серед продуктів їх життєдіяльності містилися речовини стимулюють належним чином імунітет теплокровного. Мільйони років еволюц живого на планеті створили такі чудові і досконалі механізми придушення патогенної мікрофлори непатогенних, що сумніватися в успіху такого підходу не доводиться. Непатогенних мікрофлора в конкурентній боротьбі перемагає у безспірному більшості випадків і, якщо б це було не так - нас з вами не було б сьогодні на нашій планеті. У зв'язку з вищесказаним результати праці, представлені у вигляді препаратів пробіотиків, виконані в різних препаративних формах (порошки, капсули, рідини, гелі і т.д.), призначені для придушення росту розвитку патогенної і умовно - патогенної мікрофлори в місцях її проживання (шлунково -кишковий тракт теплокровних, шкіра, статеві органи, грунт і т.д.).
Адреса: Росія, 630559, Новосибірська область, Новосибірський район, р.п. Кольцово, промзона, корпус 200, Телефон / факс: (383) 325-30-76, 336-52-65, 336-71-32, 306-14-47, 336-52-66, 306-15-61, 306-15-46, E-mail: tdkol@yandex.ru
Біологічно активна речовина Ветом 1.1: застосовується як додаткове джерело пробіотичних мікроорганізмів. Оздоровчий ефект забезпечується властивостями бактерій Bacillus subtilis, які, розмножуючись переважно в товстому відділі кишечнику, виділяють: протеолітичні, амілолітичні, целлюлозолітіческіе ферменти; інтерферон а-2 лейкоцитарний людський; бацитрацин, що пригнічують ріст і розвиток патогенно та умовно патогенної мікрофлори; інші біологічно активні речовини. Внаслідок цього процесу мікробний склад кишечника трансформується до відповідного еволюційно склалася нормі, очищаються його стінки від нетравне залишків їжі, що сприяє активному виводити токсини з організму, безперешкодної доставки біологічно активних і поживних речовин. Під впливом Ветом 1.1 нормалізуються: травлення, всмоктування і метаболізм заліза, кальцію, жирів, білків, вуглеводів, тригліцеридів, амінокислот, дипептид, cахаров, солей жовчних кислот, кислотність середовища в шлунково-кишковому тракті. Ветом 1.1 стимулю напрацювання організмом ендогенних інтерферонів, що забезпечує оптимальне функціонування імунної системи.
Склад: Цукроза, екстракт кукурудзяний, крохмаль картопляний, і висушена біомаса бактер Bacillus subtilis (рекомбінантного штаму МКПМ 7092, яка продукує інтерферон альфа-2-лейкоцитарний людський).
Властивості:
• Має високу антагоністичною активністю до широкого спектру патогенних і умовно-патогенних грибків і бактерій, противірусної активністю, а також протеолітичної, амілолітичні, целлюлозолітіческой активністю
• стимулю клітинні і гуморальні фактори імунітету
• підвищу неспецифічну резистентність організму
• стабілізу алергічну резистентність
• нормалізу обмін речовин
• стимулю регенераційні процеси
Форма випуску:
1. Порошок, розфасований по 5 г, 50 г, 500 г.
2. Капсули - 50 шт по 33 мг.
Препарат явля собою дрібний кристалічний продукт, який містить мікробну масу живих клітин спорових форм бактерій Bacillus Subtilis. Препарат має солодкий смак і легко розчиняється у воді.
Механізм дії: При прийомі препарату Ветом-1.1 бактерії Bacillus subtilis, заселяють шлунково-кишковий тракт, розмножуються в ньому протягом двох-п'яти діб і потім повністю виводяться з організму в основному нирками шляхом клубочково фільтрації. У процесі життєдіяльності ці бактерії виділяють Літичні ферменти, здатні знищувати патогенну мікрофлору, елементи пухлинних новоутворень та інш дефективних клітини. Препарат починає діяти через 15-20 хвилин після прийому. Ферменти, що виробляються бактеріями, сприяють більш активному перетравлення рослинної й тваринної їжі, забезпечуючи більш якісне харчування організму в період застосування препарату. Ці ж ферменти сприяють відновленню функцій стінок шлунково-кишкового тракту, що дозволяє біологічно активних і поживних речовин безперешкодно потрапляти в кров, а також посилюють еллімінацію детотоксикацію ксенобіотиків різного походження (токсинів патоненних мікроорганізмів, пестицидів, продуктів життєдіяльності клітин організму та ін.) У хворих із злоякісними пухлинами препарат застосовується як загальнозміцнюючого і детоксикуючі кошти та кошти, відновлюючого протипухлинну резистентність організму.
Спосіб застосування та дозування: кратність прийому Ветом 1.1 знаходиться в прямій залежності від стану організму людини. Порошок застосовувати протягом 10 днів з розрахунку 1 чайній ложці або 1 капсула від 3 до 10 разів на день залежно від захворювання.
Побічна дія: при прийомі препарату можливе виникнення больових відчуттів в уражених частинах організму. При деяких типах дисбактеріозів на першому етапі спостерігається сильний пронос або рясне газовиділення. Після прийому препарату істотно знижується ступінь і швидкість алкогольного сп'яніння при вживанні спиртних напоїв. Концентрація спирту етилового в повітрі, що видихається орієнтовно в 200 разів знижується щодо аналогічних показників у людини яка не брала Ветом.
Протипоказання: препарат не рекомендується застосовувати при цукровому діабеті. Протипоказанням служить тільки індивідуальна непереносимість діючого початку. Вона може бути виражена у вигляді алергії па сінну паличку. Цей вид захворювання зустрічається вкрай рідко і може бути виражений у вигляді висипки на тілі. У цьому випадку застосування препаратів необхідно припинити. Висипання пройде через кілька днів. Термін придатності 2 роки від дати виготовлення [16].
4. ГАЛУЗІ ВИКОРИСТАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
Ня сьогоднішній день амілолітичні ферментні препарати мають широкий спектр застосування в різних галузях промисловості. Великий відсоток застосування ферментів припада на харчову промисловість, наприклад на виробництво спирту як каталізатора процесу розрідження і оцукрювання сировини. Також ферменти застосовуються в технічний цілях, хімічної промисловості, фармацевтичних цілях, а також у якост діагностичних препаратів. [5].
4.1 Хлібопекарська і крохмалепаточна промисловість
Дія всіх ферментних препаратів тим помітніше, чим довший процес дозрівання тіста. У зв'язку з чим необхідно встановлювати кількість ферментного препарату в залежності від способу виготовлення тіста і тривалості бродіння напівфабрикатів[5].
Так, ферментн препарати, що містять мальтогенну β-амілазу, призначені для подовження терміну зберігання свіжості хліба за рахунок істотного зниження швидкост рекристалізації амілопектинової фракції крохмалю. При температур клейстерізаціі крохмалю цей фермент розщеплює амілози і амілопектин з освітою в основному олігосахаридів, які сповільнюють процеси черствіння хліба. Внесення цього препарату в тісто робить позитивний вплив на обсяг хліба, суттєво покращує структурно-механічні властивості м'якушки, збільшує термін зберігання свіжості готових виробів до 5-7 діб.
β-Амілаза, оцукрюючи крохмаль, що міститься в тісті, сприяє накопиченню цукрів, необхідних для спиртового бродіння в тісті. Ферментні препарати з амілазою будучи додані в кількості 20-25 г на 1 т борошна, покращують якість і аромат хліба, прискорюють дозрівання тесту на 30%, скорочують витрати на виробництво цукру вищих сортів булочних виробів вдвічі, збільшують пористість м'якушки та об'єм хліба на 20% [1, 22].
Амілолітичн ферментні препарати використовують також у крохмалепаточному виробництві для отримання різних видів паточно- і глюкозо-фруктозних сиропів[5].
4.2 Пивоваріння та спиртова промисловість
Амілолітичн препарати широко випускаються в нашій країні і за кордоном. В основному це великотоннажне виробництво. Амілази зна ¬ дят застосування майже у всіх областях, де переробляється крахмалсо-тримає сировину. Амілази використовують для оцукрювання зернового і картопляного крохмалю. Найбільшим споживачем амілолітичн ферментів є спиртова і пивоварна промисловості, де на сьогоднішній день солод (пророщене зерно) успішно замінюється амілолітітичними ферментними препаратами. Амілази – ферменти прискорюють реакцію оцукрювання крохмаль. Економічний ефект застосування амілаз досить значний. У пивоварінні використання ферментних препаратів дозволяє економити 165 г ячменю при виробництві кожного декалітра пива. Застосування амілази в спиртовій промисловість можливість повністю відмовитись від зернового солоду і одночасно збільшити вихід спирту із сировини на 1,5% при зниженні собівартості декалітра спирту. Широкі перспективи обіця використання ферментів у виноробстві [4, 24].
4.3 Текстильна промисловість та побутова хімія
Також ферменти використовують в текстильній промисловості для розшліхтування тканин приготування висококонцентрованих клейстером крохмалю в процесі фарбування тканин[8].
Амілолітичн ферменти застосовують у виробництві пральних порошків. Амілаза виводить з білизни крахмалсодержащіе залишки їжі. Виробництво ферментів при виробництв пральних порошків просто необхідно, щоб підвищити миючу здатність. За оцінками фахівців - технологів частка ферментів в загальній миючої здатності порошку становить 30-35%. Навіть незначне додавання ферментів в пральний порошок значно збільшує його миючу здатність [2, 6].
4.4 Фармацевтична промисловість
Амілолітичн ферменти широко використовують для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту. Використання цих ферментів у медицині вельми перспективно, і, безсумнівно буде розширюватися. Труднощі в застосуванні ферментних препаратів для цілей медицини полягають у необхідності очищення їх від пірогенних речовин, токсинів та інших домішок [36]. Амілаза - фермент, гідролізується Глікозидний зв'язку в полісахариду. Основна функція даного ферменту полягає в переварюванн крохмалю і глікогену. У зв'язку з наявністю полісахаридних фрагментів у склад клітинної стінки бактерій, наголошується розщеплення цих полісахаридів розвиток бактеріостатичної дії амілази, яка найбільш виражена з ферментів цього підкласу - у лізоциму. Спільна дія цих ферментів забезпечує неспецифічну захист проти бактеріальної інфекції[24].
5. СУЧАСНІ НАУКОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ, ПОВ`ЯЗАНІ З РОЗРОБКОЮ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
5.1 Комп'ютерне моделювання структури амілолітичних ферментів
При вивченн механізмів ферментативного каталізу класичними методами (ІЧ і УФ-спектроскопія, електронна спектроскопія, ЯМР і т.д.) додаткову інформацію вносить комп'ютерне моделювання білкових молекул з використанням даних рентгеноструктурного аналізу (РСА). Здатність глобулярних білків утворювати якісні монокристали, в яких вс атоми ідентичні і орієнтовані однаковим чином, дозволила вивчати їх за допомогою методу кристалографії. Відомо, що дані рентгеноструктурного аналізу завжди правильно відображають укладання білкової ланцюга, а в переважній більшості випадків буквально відтворюють активну конформацію ферменту. Отже, вони є надійною і поки що єдиною основою для кількісного опису механізму каталітичного акта на атомно-молекулярному рівні. Метод кристалографії дозволя розшифровувати тривимірні структури комплексів ферментів з інгібіторами, які в тій чи іншій мірі відповідають хімічним стадіях каталізу. Маючи в своєму розпорядженні рентгеноструктурних даними, одна частина яких відповіда реальному вихідного стану ферменту, а інша - фермент-інгібіторної комплексам, стає можливим відтворення механізму каталітичного акта, а, отже, можна простежити динаміку поведінки білкової макромолекули [1]. Розробляються в даний час програми комп'ютерного моделювання білкових молекул на основі результатів кристалографії дозволяють одержувати наочні тривимірні зображення досліджуваних об'єктів, і по-новому осмислити дані експериментальних досліджень кінетики-термодинамічних властивостей ряду ферментів, отримані за останн десятиліття, а, отже, виявити додаткові аспекти молекулярних механізмів ферментативного перетворення субстрату. У зв'язку з цим метою даної роботи аналіз топології амілолітичні ферментів з використанням програми MolScript по даних рентгеноструктурного аналізу. Підвищений інтерес до амілаза зумовлений їх широким застосуванням у медицині, харчовій і легкій промисловості як ефективн біокаталізаторів. Дослідження фізико-хімічних властивостей, кінетика-термодинамічних параметрів, особливостей фермент-субстратні взаємодій при здійсненні акту каталізу амілолітичні ферментами сприяли суттєвому зміни й удосконалення багатьох існуючих технологій і створення нових. Однак, очевидним брак інформації про просторової організації макромолекул ферментів дано групи.
Об'єктом наших експериментальних досліджень є глюкоамілаза з Aspergillus awamori, препарат Г-20Х виробництва Ладижинського заводу ферментних препаратів. Для визначення активності глюкоамілази використовували глюкозооксідазний метод. Визначення загальної кількості білка в ферментні препарати проводили за методом Лоурі. Дослідження співвідношення типів вторинної структури здійснювали методом нфрачервоної спектроскопії на спектрометрі Specord M-80 (Німеччина). Визначення молекулярної маси глюкоамілази, а також вивчення четвертинно структури ферменту з використанням додецилсульфату натрію у концентрації 3,5 × 10-5 моль / л для руйнування надмолекулярних рівня організації, проводили за допомогою гель-хроматографії на сефадексе G-200. Кількісне визначення SH-груп здійснювали методом, заснованому на вимірюванні приросту оптичної щільності в області 255 нм при приєднанні n-меркурібензоата до SH-групам. Для кількісного визначення SS груп використовували метод, заснований на вимірюванні оптичної щільності (l = 412нм.) При утворенні нітротіобензоата. Визначення числа йоногенних груп проводили на автоматичної установки, розробленої на кафедрі біофізики та біотехнології ВДУ, шляхом порівняння кривих титрування білка. Вивчення просторової структури глюкоамілази здійснювали з використанням програми MolScript.
Програма MolScript використовується для моделювання протеїнових і протеідових структур. Вихідними даними для програми є *. in файл, в якому вказується файл рентгеноструктурного аналізу, об'єкти для виводу і точну їх опис за допомогою графічних параметрів. Для створення в першому наближенні вхідних файлів MolScript використовується програма MolAuto. Ця програма розпізнає вторинну структуру у файлі pdb і виводить відповідні команди для схематичного опису даної структури. MolAuto має кілька ключів, які дозволяють впливати на властивості об'єктів. Програма не здатна вибирати зручний ракурс, тому користувачеві необхідно вибирати його самостійно. MolAuto може бути частиною потоку UNIX з програмою MolScript: наприклад для швидкого отримання зображення структури в режимі OpenGL. Кожен формат, підтримуваний MolScript, волод своїми специфічними властивостями. Тому вибір формату проводиться з урахуванням встановленого програмного забезпечення і бажаного набору властивостей отримано моделі.
Програма MolScript використовує одну фіксовану правостороннім систему координат з ціною ділення 1 ангстрем. Точка огляду зафіксована і змінитися не може. Для перегляду молекули з різних ракурсів атомні координати необхідно трансформувати, тобто повернути і / або транслювати в межах системи координат. Молекулярні координати зчитуються з pdb файлу, а самі координати атомів і залишків, що входять в дане зображення, використовуються графічними командами. Координати обраних атомів трансформуються матрицею, визначеної однією або кількома операціями.
При вивченн топології для двовимірних статичних і тривимірних моделей проводилося розпізнавання субодиниць ферментів в різних масштабах по різних напрямах. Топологічні питання розглядалися як для фрагментів, так і для цілісних молекул амілолітичні ферментів, що дозволило ввести позначення функціонально значущих груп.
Класичні методи вивчення особливостей перебігу ферментативного каталізу дозволяють розглядати широке коло питань. Так, експериментальним шляхом нами було досліджено вплив різних фізико-хімічних факторів на конформацію макромолекули глюкоамілази з Aspergillus awamori та пов'язаних з нею механізмів активації та інактивац даного ферменту; Вивчено кінетику-термодинамічні аспекти реакції гідролізу крохмалю. Методом гель-хроматографії визначена молекулярна маса глюкоамілази, що становить 106 кДа. Дослідження амінокислотного складу глюкоамілази показало, що молекула ферменту містить 26,8% амінокислотних залишків з алкільних бічними ланцюгами (Ala, Val, Leu, Met, Ile), що визначають високу стійкість ферменту до органічних розчинників. Виявлено високий вміст у молекулі глюкоамілази Ser Thr. Результати наших експериментів і аналіз даних літератури з секвенування глюкоамілази (А. Е. Альошин та ін, 1994) дозволяють зробити висновок про те, що молекула ферменту має 6 SH-груп та 4 дисульфідних зв'язку, що стабілізують його третинну структуру. Вивчення надмолекулярних рівня організації глюкоамілази показало наявність четвертинної структури, представленої двома ідентичними субодиниця з молекулярною масою 53600Да, що володіють каталітичної активністю. Її стабільність визначається водневими зв'язками і гідрофобними взаємодіями може залежати від невеликих змін в просторовій структурі кожної з взаємодіючих субодиниць. Причому четвертинна структура, очевидно, має здатність передач структурних перебудов від однієї субодиниці до іншої і є одним з факторів регуляції функціональної активності молекули білка.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
