Курсовая работа: Свободные аминокислоты нервной системы
3. Глутамат и аспартат
Особенностью метаболизма глутамата в нервной ткани является его тесная связь с интенсивно функционирующим в этом органе циклом трикарбоновых кислот, что и позволяет считать его промежуточным продуктом энергетического метаболизма. Так, уже через 30 мин после инъекции меченой глюкозы более 70% радиоактивности растворимой фракции приходится на долю глутамата и его производных. Этому способствует чрезвычайно быстрое взаимопревращение глутамата и а-кетоглутарата в ЦНС. Высокий процент включения радиоактивности из глюкозы в аминокислоты мозга явился основанием для предположения, что утилизация глюкозы в этом органе в значительной степени происходит через биосинтез и окисление аминокислот.
Непосредственным предшественником для синтеза глутамата в мозге является а-кетоглутаровая кислота, которая может превращаться в глутамат или путем прямого восстановительного аминирования с участием глутаматдегидрогеназы, или путем переаминирования.
Энзим менее активен в мозге, чем в печени, присутствует в митохондриях, требует в качестве кофакторов пиридиннуклеотидов и активируется АДФ. Км этого энзима для аммония близок к 8 мМ. Реакция обратима, однако равновесие сильно сдвинуто в сторону прямой реакции, т.е. синтеза глутаминовой кислоты.
Таким образом, в головном мозге глутаматдегидрогеназная реакция участвует не столько в окислении глутамата, сколько в синтезе его из а-кетоглутаровой кислоты, обеспечивая тем самым непрерывное превращение свободного аммиака в аминоазот аминокислот. Основной же путь окисления глутамата в мозге - через переаминирование.
В митохондриях мозга 90% глутамата подвергается переаминированию с образованием аспартата. Фермент, катализирующий переаминирование глутамата с щавелевоуксусной кислотой, - аспартатаминотрансфераза является наиболее мощной трансаминазой головного мозга. Выделены два изоэнзима аспартатаминотрансферазы, локализованных в митохондриях и цитоплазме. Функциональная роль их различна. Митохондриальный фермент связан в основном с функционированием ЦТК, цитоплазматический определяет интенсивность глюконеогенеза.
Как уже отмечалось, путь метаболизма глутамата через переаминирование намного активнее дегидрогеназного. В регуляции соотношения между этими двумя путями, конкурирующими за один субстрат, важная роль принадлежит макроэргическим соединениям. В интактных митохондриях энзим взаимодействует по преимуществу с НАДФ+ и интенсивность реакции пропорциональна отношению НАДФ+/НАЦФН2. Макроэргические соединения способствуют превращению НДЦФ+ в НАДФН2 и тем самым подавляют дезаминирование глутамата. Наоборот, трансаминазный путь требует расходования макроэргических соединений. Поэтому выбор между этими двумя реакциями определяется энергетическими возможностями митохондрий.
При нормальном функционировании ЦТК дегидрогеназный путь окисления глутамата подавлен, а трансаминазный активно протекает. В результате уменьшения количества макроэргических соединений, например при добавлении к митохондриям разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4-динитро-фенола, подавляется трансаминазный путь при одновременном резком усилении дегидрогеназного пути окисления глутамата.
Взаимопревращение а-кетоглутарата и глутамата происходит чрезвычайно быстро. В мозге был идентифицирован метаболический путь такого взаимопревращения, получивший название аспартат-малатного шунта, служащего для транспорта восстановительных эквивалентов из цитозоля в митохондрии.
Уже упоминалось, что различные органеллы клеток мозга могут индивидуально контролировать уровни аминокислот, накапливая их против градиента концентрации. Примером этого могут служить изолированные из ЦНС митохондрии, которые быстро поглощают глутамат и малат, освобождая соответствующие количества аспартата и а-кетоглутарата. Это означает, что ток аспартата через митохондриальную мембрану связан с током глутамата в обратном направлении; также реципрокно связаны ток малата и а-кетоглутарата. Энзимы, катализирующие отдельные реакции малат-аспартатного шунта, превалируют в тканях ЦНС. В нейронах малат-аспартатный шунт является преобладающим механизмом переноса восстановительных эквивалентов в митохондрии.
Таким образом, глутаминовая кислота выполняет чрезвычайно важную функцию в энергетическом обеспечении головного мозга, которая заключается в поддержании метаболитов ЦТК на определенном и довольно высоком уровне, а также в снабжении митохондриальных синтетических процессов восстановительными эквивалентами.
Большое значение имеет образование аммиака из глутамата. В головном мозге обнаружены многочисленные аминотрансферазы основных, кислых, нейтральных и ароматических аминокислот. При участии этих ферментов аминогруппы различных аминокислот переносятся в конечном счете на глутамино-вую кислоту. Последняя переаминируется с ЩУК при участии аспартатами-нотрансферазы с образованием аспартата. Образование аммиака из аспартата происходит различным образом в митохондриях и цитоплазме. В митохондриях этот процесс связан с аминированием дезаминоформ НАД+ и включает в себя три ферментативных реакции.
Вне митохондрий действует другой циклический процесс образования аммиака, в котором аспартат реаминирует инозинмонофосфат.
Для удаления аммиака в ЦНС служит глутаминсинтетазная реакция.
Глутаминсинтетаза катализирует реакцию:
Этот энзим в мозге животных находится в более высокой концентрации, чем в других органах, составляя 0,2% от общего белка мозга. Энзим требует АТФ и Mg+ и подавляется глицином и аланином. Км для аммония - порядка 0,39 мМ, т.е. при нормальной концентрации аммония в мозге фермент работает в режиме полунасыщения. В нормальных физиологических условиях, когда имеется достаточный уровень АТФ, глу-таминсинтетазная реакция направлена в сторону связывания аммиака.
Образование глутамина является важным механизмом детоксикации аммония, к которому мозг чрезвычайно чувствителен и накопление которого губительно для ЦНС. В частности, повышение аммиака в мозге до концентрации 0,6 мМ сопровождается судорогами. Системное введение солей аммония вызывает конвульсии и увеличение содержания глутамина в мозге. В случае серьезных повреждений печени повышается концентрация аммония и глутамина в спинномозговой жидкости - в этих случаях наблюдается кома. Симптомы печеночной комы смягчаются введением глутамата. Основная часть глутаминсинтетазы локализована в глиальных клетках и лишь небольшая часть ее представлена в нервных окончаниях.
Дезаминирование глутамина катализируется глутаминазой, ферментом, наиболее активным в нейронах, где он локализован в митохондриях. Следует отметить, что активность этого фермента в головном мозге невелика; продукты реакции - глутаминовая кислота и аммоний - тормозят активность фермента.
Предполагается участие этого фермента в мембранном транспорте глутамата. Известно, что биологические мембраны более проницаемы для глутамина, чем для глутамата, и глутаминаза может участвовать в превращении глутамина крови во внутриклеточный глутамат. Глутаминаза играет важную роль также в регуляции содержания глутамата в нервных окончаниях. Тот факт, что глутаминсинтетаза локализована в основном в глиальных клетках, а глутаминаза наиболее активна в нейронах, а также то, что глутамин оказался главным предшественником глутамата и ГАМ К, выполняющих трансмиттерную функцию, послужил основанием для концепции о существовании глушаминового цикла, Глутамат, поглощаясь глиальными клетками, превращается в глутамин в синтетазной реакции, последний входит в нейроны, образуя там глутаминовую кислоту. Таким образом, глутамин служит глиально-нейронааьным транспортером глутамата.
Другой важной функцией глутамата является его участие в синтезе белков и биологически активных пептидов. Глутамат и глутамин составляют вместе от 8 до 10% общих аминокислотных остатков в гидролизате белков мозга. В частности, два хорошо изученных мозгоспецифичных белка - S-100 и 14-3-2 - содержат особенно высокую долю глутаминовой кислоты. Глутамат является также составной частью ряда малых и средних регуляторных пептидов мозга. Это прежде всего глутатион и ряд у-глутамильньгх дипептидов. Некоторые нейропептиды содержат циклическое производное глутамата - аироглутамат в качестве N-терминального остатка, который предохраняет эти пептиды от протеолиза. К таким "пептидам относятся люлибе-рин, тиролиберин, нейротензин, бомбезин и др. .
Введение глутамата в различные районы мозга приводит либо к судорожной активности, либо к распространяющейся депрессии, даже если количество его мало по сравнению с нормальной концентрацией глутамата в мозге. Глутамин не вызывает такого эффекта. При внутривенном введении глутамат может вызвать гибель клеток в определенных районах ЦНС, особенно вокруг желудочков мозга, где менее развит гематоэнцефалический барьер. Нейроны незрелых животных, у которых еще отсутствует высокоразвитый гематоэнцефалический барьер, также очень чувствительны к глутамату. Оральное введение больших количеств глутамата не действует на ЦНС большинства людей, а соли глутамата широко используются в качестве пищевой приправы. Однако у некоторых лиц обнаруживается повышенная чувствительность к глутамату натрия, он вызывает сенсорные и моторные нарушения, включая ощущение жжения, напряжение лица, боль в грудной клетке и головную боль. Эти симптомы известны как "синдром китайских ресторанов", так как глутамат натрия широко используется в китайской кухне. Многие аналоги глутамата токсичны.
Остановимся на некоторых сторонах нейротрансмиттерной функции глутамата. Для того чтобы глутамат эффективно функционировал в качестве нейротрансмиттера, его модальная внеклеточная концентрация должна быть ниже той, которая вызывает деполяризацию мембран. В действительности она колеблется от 1 до 10 мкМ; такая низкая внеклеточная концентрация глутамата поддерживается активным транспортом в нейроны и особенно в глиальные клетки.
В процессе выхода глутамата в синаптическую щель концентрация его там значительно повышается - до 1 мМ.
Последующий обратный захват глутамата нейронами и астроцитами осуществляется с участием Na-зависимых высокоаффинных переносчиков, из синаптической щели глутамат удаляется в основном путем захвата астроцитами. Для функционирования глутамата в качестве нейротрансмиттера необходимо постоянное пополнение его пула в нервных окончаниях.
Предшественниками трансмиттерного пула глутамата могут быть глюкоза и а-кетоглутарат.
Глутамат может также образовываться из орнитина и аргинина. Но основным источником нейротрансмиттерного глутаматного пула, по данным изотопных исследований, оказался глутамин, который синтезируется в основном в астроцитах, где локализована глутаминсинтетаза.
Далее он легко транспортируется через мембрану астроцитов и с помощью активных переносчиков достигает нервных окончаний.
4. N-Ацетиласпарагиновая кислота
Одним из доминирующих компонентов пула свободных аминокислот мозга является N-ацетиласпарагиновая кислота
Ее концентрация у большинства видов животных в два раза превышает таковую аспарагиновой кислоты. В ненейрональной ткани обнаружены только следы АцА. Она находится в более высокой концентрации в сером веществе по сравнению с белим, представлена также в периферической нервной системе, в сетчатке. Ее концентрация низка при рождении и повышается в процессе развития животного.
АцА образуется с участием ацетил-КоА. Энзим, катализирующий эту реакцию, очищен и изучен. Точная функция АцА в мозге еще не ясна, хотя имеются предположения, что она является частью внутриклеточного фиксированного пула анионов или резервуаром ацетильных групп, а также источником N-ацетилированных конечных групп для синтеза определенных бел-
ков и пептидов мозга. Показано, что ацетильные группы экзогенной АцА кислоты служат предпочтительным источником углерода для синтеза жирных кислот в развивающемся мозге. В головном мозге оказалось два пространственно разобщенных фонда АцА: малый, высокоактивный, локализованный в глии, и большой, медленно обменивающийся, - в нейронах.
5. Гамма-аминомасляная кислота
Одним из главных компонентов пула свободных аминокислот головного мозга различных животных является у-аминомасляная кислота, продукт а-декарбоксилирования глута-миновой кислоты. Цикл превращений ГАМК в мозге включает три сопряженных энзиматические реакции, получившие название ГАМК-шунта.
Он является ответвлением ЦТК на участке от а-кетоглутарата до сукцината. При участии фермента i лугам атдекарбокс ил азы отщепляется первый карбоксил L-глутаминовой кислоты с образованием ГАМК.
Этот энзим присутствует только в ЦНС и главным образом в сером веществе. ГДК синтезируется в нейрональной соме, а затем очень быстро транспортируется вдоль аксона. ГДК нуждается в пиридоксальфосфате в качестве кофактора, как большинство других декарбоксилаз аминокислот. Кофактор прочно связан с энзимом. Молекулярная масса энзима 85 кД, Kw для глутамата около 0,7 мМ, а Км для пиридоксальфосфата 0,05 М. ГДК специфичен для глутамата, слабо взаимодействует с аспарагиновой кислотой. Скорость ГДК-реакции - лимитирующая ступень синтеза ГАМК. Уровень ГАМК в различных областях нервной системы регулируется действием ГДК и при нормальных условиях мало зависит от действия энзимов деградации ГАМК. ГДК является маркером ГАМК-ергических синапсов.
Энзимы катаболизма ГАМК локализованы отдельно от ГДК. ГАМК-трансаминаза находится в сером веществе мозга, но встречается также и в других тканях. Она также требует пиридоксальфосфат в качестве кофактора и связана с ним прочно. ГАМК-Т обнаружена в митохондриях, в то время как ГДК и ГАМК локализованы в синаптосомах. Км ГАМК-Т для всех субстратов очень высока.
Конечный энзим шунта - дегидрогеназа янтарного полуальдегида - превращает янтарный полуальдегид в янтарную кислоту. Он распространен в ЦНС там же, где и ГАМК-Т. Это митохондриальный энзим, который специфичен для янтарного полуальдегида и НАД"", активируется сульфгидрнлъными реагентами и подавляется субстратом при концентрации последнего выше 10~М.
ГАМК является наиболее широко распространенным медиатором торможения в нервной системе. У млекопитающих она локализована в нервных окончаниях тормозных нейронов ЦНС. ГАМК тормозит биоэлектрическую активность не только головного мозга позвоночных, но и нервных цепочек и ганглиев беспозвоночных животных. Соответственно ГАМК и ферменты ее обмена также локализованы в нервных структурах беспозвоночных, совпадающих с расположением тормозных синапсов. Физиологическое действие ГАМК обусловлено взаимодействием со специальными рецепторами.
6. Компартментализация метаболизма аминокислот
Компартментализация метаболизма является ключевым фактором взаимоотношений между глутаматом, глутамином и ГАМК, Впервые это явление было открыто в лаборатории Вэлша в конце 50-х - начале 60-х годов и известно под названием эффекта Вэлша. При определенных условиях в опытах с использованием меченых предшественников специфическая радиоактивность продукта, образованного в короткий промежуток времени, превышает специфическую активность предшественника иногда в несколько раз. Эти наблюдения позволяют сделать заключение, что метаболизм имеет место в малом, высокоактивном пуле, а меченый предшественник разбавляется при выделении большим количеством немеченого предшественника из другого, малоактивного пула.
Инъекция меченого глутамата, аммония, бикарбоната, ацетата, бутирата, цитрата и других, как правило, приводила к тому, что специфическая радиоактивность глутамина была выше предшественника, изолированного вскоре после инъекции. Этот эффект не был обнаружен после инъекции меченой глюкозы, пирувата, лактата, глицерина. Данные позволили заключить, что глюкогенные субстраты метаболируют до аминокислот в компартментах, отличных от тех, в которых обмениваются кетогенные субстраты.
Эффект Вэлша - специфическое свойство нервной системы и демонстрируется в опытах как in vitro, так и in vivo. В дальнейшем кинетическими исследованиями с различными метаболическими предшественниками было показано наличие в головном мозге различных метаболических компартментов цикла трикарбоновых кислот и аминокислот, связанных с этим циклом. Некоторые исследователи ограничивают число компартментов двумя - большим и малым, другие описывают до шести метаболических компартментов. Очевидным является факт, что каждый компартмент является суммой большого числа микрокомпартментов с более или менее сходными метаболическими свойствами.
