Дипломная работа: Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс
1.2.4 Биологическая роль трансаминаз
Аминокислоты, не использованные для синтеза белков и других производных, не накапливаются в организме в больших количествах. Они подвергаются различным ферментативным превращениям и, в конечном счете, распаду /32/. Важную роль в азотистом обмене играют процессы перехода одних аминокислот на другие, в результате ферментативных реакций переаминирования. При этом происходит обратимый перенос NH2 – группы от L – аминокислоты на L – кетокислоту без промежуточного образования аммиака. Таким образом, в реакции переаминирования участвуют L – аминокислота как донор и L – кетокислота как акцептор аминогруппы. Эти реакции катализируются особыми ферментами трансаминазами. Коферментом трансаминаз является пиридоксаль – 5׳ – фосфат, который и является промежуточным переносчиком аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту/27/.
Широкое распространение трансаминаз в животных тканях, у микроорганизмов и растений, их высокая резистентность к физическим, химическим и биологическим факторам, абсолютная стереохимическая специфичность по отношению к L - и Д – аминокислотам, высокая каталитическая активность в процессах переаминирования послужили предметом детального исследования роли этих ферментов в обмене аминокислот/33/. Тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно Международной классификации трансаминазы относят к 2 классу трансфераз, 4 подклассу – аминотрансферазы; наименование их составляется по форме «донор – транспортируемая группа – трансфераза» /34/. А. Е. Браунштейн выдвинул гипотезу о возможности существования в живых тканях не прямого пути дезаминирования аминокислот через реакции переаминирования, названного им трансдезаминированием. Основой для этой гипотезы послужили данные о том, что из всех природных аминокислот в животных тканях с высокой скоростью дезаминируются только L глутаминовая кислота. Согласно этой теории большинство природных аминокислот сначала реагируют с L – кетоглутаровой кислотой в реакции переаминирования с образованием глутаминовой кислоты к соответствующей кетокислоте/30/. Образовавшаяся глутаминовая кислота подвергается окислительному дезаминированию под действием глутаматдегидрогеназы. Механизм трансдезаминирования можно представить в виде следующей схемы /13/:
R1- CH (NH2)-COOH L-кетоглутарат НАДН2 + NH3
R1- CO- COOH L-глутамат НАД + Н2О
трансаминаза глутаматдегидрогеназа
Обе реакции (переаминирование и дезаминирование глутаминовой кислоты) являются обратимыми, создаются условия для синтеза любой аминокислоты, если в организме имеются соответствующие L – кетокислоты. Организм животных и человека не обладает способностью синтеза углеводородного скелета (L - кетокислот) так называемых незаменимых аминокислот, этой способностью обладают только растения и многие микроорганизмы.
В живых организмах осуществляется синтез природных аминокислот из L кетокислот и аммиака, этот процесс был назван А. Е. Браунштейном трансреаминированием. Сущность его сводится к восстановительному аминированию L – кетоглутаровой кислоты, с образованием глутаминовой кислоты, и к последующему переаминированию глутамата с любой L – кетокислотой. В результате образуется L – аминокислота, соответствующая исходной кетокислоте, и вновь освобождается L – кетоглутаровая кислота, которая может акцептировать новую молекулу аммиака/35/.Схематически роль трансаминаз в дезаминировании в биосинтезе аминокислот можно представить в следующем виде/28/:
L-Аминокислота Пиридоксальфосфат L-Глутамат НАД
R1-CH(NH2)-COOH
O=CH-ПФ HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH
НАДФ
Трансаминаза
НАДФН2
R1-C-COOH
H2N-CH2-ПФ
HOOC-(CH2)2-C(NH)-COOH НАДН2
L-кетокислота Иминоглутарат
Пиридоксаминфосфат
Н2О
HOOC-(CH2)-C-COOH
L-кетоглутарат
NH3
Схема показывает, что трансаминаза катализирует опосредованно через глутаматдегидрогеназу как дезаминирование природных аминокислот (стрелки вниз), так и биосинтез аминокислот (стрелки вверх).
Путем переаминирования большинство аминокислот может превращаться одна в другую или заменяться соответствующей кетокислотой. Поэтому реакции переаминирования - один из важнейших процессов при биосинтезе заменимых аминокислот. Особенно легко переаминируются глутаминовая и аспарагиновая кислоты, так как соответствующие им трансаминазы имеют очень высокую активность. Кетокислоты, получаемые из этих аминокислот (L – кетоглутаровая и щавелевоуксусная кислоты), осуществляют связь углеродного и белкового обмена /36/.
Таким образом, трансаминазы играют важную роль в азотистом обмене, участвуют в биосинтезе аминокислот. Биологический смысл реакций переаминирования аминокислот состоит в том, чтобы объединить аминогруппы распадающихся аминокислот в составе молекул одного типа аминокислоты, а именно глутаминовой /31/.
Трансаминазы относятся к универсально-распространенным ферментам. В тканях различных органов содержится значительное количество трансаминаз, в сотни и тысячи раз превышающее уровень активности их в сыворотке крови. При электрофорезе они мигрируют с L - и γ - глобулинами. Особенно высокой активностью АСТ (КФ.2.6.1.1.) отличаются сердце, печень, мышечная ткань, почки, поджелудочная железа (перечень представлен в порядке убывания активности АСТ). АЛТ (КФ.2.6.1.2.) в наибольших количествах обнаруживается в печени, в связи с этим ее называют печеночной трансаминазой, затем в поджелудочной железе, сердце, скелетных мышцах.
Значительные различия в активности трансаминаз в отдельных органах и в сыворотке крови определяют его важное клиническое диагностическое значение, так как при поражении ткани возникает резкий скачок уровня активности трансаминаз в крови. Наибольшее значение представляет повышение активности АСТ при инфаркте миокарда. Степень повышения отражает массовость поражения сердечной мышцы и тяжесть инфаркта. Характерна динамика активности АСТ при инфаркте миокарда: начало подъема - через несколько часов после возникновения заболевания, максимальный подъем – к концу первых суток, нормализация возможна в течение первой недели болезни. При других заболеваниях сердца повышение активности АСТ либо не происходит, либо носит умеренный характер. Однако активность АСТ повышается и при поражении других органов и тканей. Многие авторы склонны рассматривать определение АСТ как ценный тест при проведении дифференциальной диагностики между инфарктами сердца и легких. Основанием к этому служит значительно более высокая (в 50 раз) активность фермента в мышце сердца, в сравнении с тканью легкого. Активность трансаминаз в сыворотке крови является одной из наиболее ценных и самым распространенным в клинической практике показателем поражения печени, характеризующие протекающие в ней цитолитические процессы /37/.
Повышение активности аминотрансфераз, и, прежде всего АЛТ, выявляется уже в ранний, инкубационный, преджелтушный период вирусного гепатита, что имеет принципиальное эпидемиологическое значение для выявления больного еще до появления желтухи. В результате значительного повышения активности АЛТ у больных вирусным гепатитом снижается коэффициент Де Ритиса (АСТ: АЛТ) ниже 1 при норме 1 – 3, а при остром инфаркте миокарда, напротив, резкое возрастание этого коэффициента /38/.
При хронических гепатитах и циррозах печени соотношение трансаминаз меняется, и коэффициент повышается выше нормы. Важно иметь в виду, что механические желтухи (непроходимость желчных протоков в связи с желчекаменой болезнью или опухолью) не сопровождаются выраженным повышением трансаминазной активности. Возможно повышение активности трансаминаз при воспалительных заболеваниях различных органов и тканей, при мышечных дистрофиях и т. д. /37,38/.
Таким образом, в настоящее время установлено, что переаминирование является весьма важным и распространенным процессом биологического распада и синтеза аминокислот; он протекает в различных тканях животных, растений и в микроорганизмах. Поэтому исследование этого процесса имеет большое фундаментальное и прикладное значение.
2. Материалы и методы
2.1 Экспериментальная часть
2.1.1 Экспериментальные животные
Эксперимент проводился на самках белых беспородных крыс средней массы 250-300 г. Животные подвергались токсическому действию азотнокислого кадмия (Cd(NO3)2) во время лактации. Введение нитрата кадмия производилось самкам per os в течение 10 дней (с 1 по 10 день после рождения потомства) в дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг /39/. По достижении потомством экспериментальных животных четырехмесячного возраста их декапитировали и производили отбор органов и тканей для определения активности АСТ и АЛТ.
В качестве контроля использовали животных, которым в период лактации вводили в соответствующем объеме физиологический раствор.
2.1.2 Подготовка биологического материала
2.1.2.1 Подготовка сыворотки крови
После декапитации животных кровь собирали в гепаринизированные пробирки и для получения сыворотки подвергают центрифугированию, при 3000 об/мин, в течение 15 минут. После центрифугирования получали сыворотку, не содержащую форменных элементов крови. Затем отбирали сыворотку в пробирки, и производили определение активности АСТ и АЛТ методом Райтмана – Френкеля/40/ с помощью стандартных наборов реактивов.
2.1.2.2 Подготовка гомогенатов тканей и органов
Извлеченные органы (печень, головной мозг, сердце, почки) отмывали от крови физиологическим раствором, взвешивали 1-2 грамма ткани, измельчали ножницами и растирали в ступке. Все операции производили на холоду. Затем добавляли среду выделения (0,005 N Tris, 0,1 N KСl, pH7,4) в отношении 1: 50 для головного мозга, сердца и почек, и 1:100 – для печени. Полученные гомогенаты переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 4500 об/мин 10 минут. После центрифугирования супернатант переносили в другие пробирки, а осадок выбрасывали. Далее в супернатанте производили определение активности АСТ и АЛТ методом Райтмана – Френкеля /40/ при помощи стандартных наборов реактивов.
2.2. Определение активности аминотрансфераз методом Райтмана – Френкеля
АСТ в присутствии L - кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L - -аспартата с образованием оксалоацетата, который декарбоксилируется до пирувата /41/:
L – кетоглутарат + L - аспартат → L – глутамат + оксалоацетат → ПВК
АЛТ в присутствии L – кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L – аланина с образованием пирувата /41/:
L – кетоглутарат + L - аланин → L – глутамат + ПВК
Пируват с 2,4 динитрофенилгидразином (2,4 - ДНФГ) в щелочной среде образует окрашенный гидразон, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна активности АСТ и АЛТ.
2.2.1 Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
В обычные пробирки наливали 0,5 мл субстрата (L аспартат (L - аланин) 0,1 моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови. Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли сыворотку. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа – АСТ и 30 минут – АЛТ при 37С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам приливали по 0,5 мл раствора 2,4 ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,1 мл сыворотки крови. Через 20 минут (20-25 оС) в пробирки приливали по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH, хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt 537нм) в кюветах толщиной 1см.
Расчет активности ферментов в сыворотке крови производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: каталитическая концентрация АСТ(АЛТ)= (Епр – Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр – экстинция пробы, Ек экстинция контроля.
Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мл стандартного раствора пирувата. К пробам, содержащим от 0,5 до 0,25 мл субстрата (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пирувата), добавляли 0,5мл раствора 2,4 – ДНФГ, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1. Калибровочный график строили, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс соответствующие им значения активности АСТ и АЛТ.
2.2.2 Определение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в гомогенатах органов
В пробирки наливали 0,1 мл разбавленного гомогената тканей печени, головного мозга, сердца, почек и 0,5 мл субстрата (субстрат предварительно нагревали на водяной бане до 37 оС). Параллельно ставили контрольные пробы, в которые не добавляли субстрата. Пробы хорошо перемешивали и инкубировали в течение 1 часа при 37 о С на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам прибавляли по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после добавления 2,4 – ДНФГ приливали 0,5 субстрата. Пробы оставляли на 20 минут при комнатной температуре, затем во все пробирки приливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, тщательно перемешивали и через 30 минут измеряли оптическую плотность при 505 нм, в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.
Расчет активности ферментов в гомогенатах органов производили по калибровочному графику. Каталитическую активность АСТ(АЛТ) рассчитывали в мкмоль/(с·л) по формуле: АСТ(АЛТ) = (Епр- Ек)К, где К – коэффициент рассчитанный по калибровочному графику: К=С/Е, Епр - экстинция пробы, Ек – экстинция контроля.
Калибровочный график для определения аминотрансфераз в гомогенатах тканей строили так же, как для сыворотки крови. Для расчета активности ферментов учитывали все разведения гомогената и выражали в пересчете на 1 грамм ткани (мг белка).
Все экспериментальные группы содержали от 7 до 9 животных, полученные данные были подвергнуты статистической обработке. Достоверность различий между группами оценивали с учетом критерия Стюдента, в соответствии с общепринятой методикой /42/.
Результаты и обсуждение
